Модификация и репарация ДНК


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
Модификация ДНК.

Репарация
ДНК.

к.б.н., доцент Рогожин В.Н.

Модификация ДНК

Метилирование ДНК



основной тип модификации ДНК у эу
-

и прокариот.
Заключается в ферментативном присоединении
CH
3
-
группы к некоторым
нуклеотидам ДНК.

Метилирование происходит:

-
когда:

в разное время клеточного цикла;

-
где и что метилируется:

ЭУкариоты

ПРОкариоты


(на примере
E.coli
)

1.
Ядро, митохондрии, пластиды

2.
Метилируется
:

Цитозин

→ 5
-
метилЦитозин в парах:
5’
-
CG
-
3’

(
CpG
-
повторы)


5’
-

C
me
G

-
3’.


60
-
80%
CpG

метилируется

(
млекоп
)
.

Фермент


ДНК
-
метилаза
.



(
У растений
метилируются

еще и
5’
-
CpNpGp
-
3’



повторы
)

1.
Нуклеоид
-
цитоплазма

2.
а)
Метилируется
:

Аденин

→ 6
-
N
-
метилАденин


в
5

-
GATC
-
3’



5

-
GA
me
TC

-
3’

Фермент


dam
-
метилаза
.
Происходит часто.


б)
Метилируется


Цитозин

→ 5
-
метилЦитозин

в
5

-
CC(A/T)GG
-
3’


5

-
C
me
C
(A/T)GG
-
3’

Фермент


dcm
-
метилаза
.


Происходит редко.

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

Метилирование ДНК

ЭУкариоты

ПРОкариоты

(на примере
E.coli)

3. Расположение метилированных нуклеотидов в ДНК

-

Промоторы

генов белков,
репрессирующих
функциональную
активность

клетки (
p53


индуктор
апоптоза
,
AGE



гены «старения»
)
.

-

Центромерные

участки
.

-

Распределены более или менее
равномерно
.

(продолжение)

Участники процесса (общее для эу
-

и про
-
):

-

ДНК;

-
Фермент ДНК
-
метилаза

(
ДНК
-
метилтрансфераза,
DNMT)
;

-
S
-
аденозилметионин (
SAM
)


активная форма метионина


донор метильных групп.


Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

Метилирование ДНК

Цитозин


Аденин

5
-
метилцитозин


6
-
N
-
метиладенин

ДНК
-
метилаза

S
-
аденозилметионин

S
-
аденозилгомоцистеин

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

Как меняет свойства ДНК
метилирование?

1.
Цитозин → 5
-
метилцитозин:


а) Усиление взаимодействия с комплементарным Гуанином.


б)
Для Эукариот
: с метилированными (5
-
mC)

последовательностями взаимодействуют
метилцитозин
-
связывающие белки



MeCP1
и
MeCP2 (
M
-
C
pG
-
binding
P
rotein)
.


2.

Аденин

→ 6
-
N
-
метиладенин:


а) Модификация
-
мечение ДНК:

-

«своя»
-
«не своя»

-

«старая цепь»
-

«новая цепь»

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

Значение метилирования

I.
Метилирование

Цитозина

(
C
me
pG
)
:


1.
Регуляция активности генов (на стадии транскрипции)
.


Механизмы регуляции:


а) Более прочное взаимодействие 5
-
mC

с
G

на противоположных цепях в
промоторных

областях генов затрудняет работу РНК
-
полимеразы
II

(затруднение локального
расплетения

цепей).

б) Взаимодействие
C
me
pG

с
метилцитозин
-
связывающими белками
MeCP1/2

связывание
гистоновой

деацетилазы

(
HDAC)


деацетилирование

гистонов
(повышение «+»
-
заряда
нуклеосом
) →
ремодуляция

хроматина в
конденсированную фракцию (
гетерохроматин
).

Положительная корреляция между функциональной активностью клеток и
содержанием 5

-
метилцитозина
.


Уменьшение
метилированности

CpG
-
повторов → старение клетки (снижение их
функциональной активности, смерть).

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

Значение метилирования

I.
Метилирование

Цитозина

(
C
me
pG
)
:



Механизмы снижения
метилированности

CpG
:

а)
Деметилирование
:
5
-
метилцитозин →
Цитозин

(
ДНК
-
деметилаза
)

б)
Эксцизионное

удаление 5
-
метилцитозинов
: вырезание фрагмента ДНК (с
метилцитозинами
) и замена его
неметилированным

участком. Возможно с
помощью системы репарации ДНК.

в) Спонтанное гидролитическое
дезаминирование

5
-
метилцитозина →
тимин
.
Следствие: комплементарная пара
C
me
-
G
, меняется на
некомплементарную

T
-
G
.

г)
Для делящихся клеток
:
подавление активности
(экспрессии)
ДНК
-
метилаз
.



Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

I.
Метилирование Цитозина (
C
me
pG)
:


2. Предупреждение преждевременной репликации центромерных
областей ДНК.






Центромерные участки ДНК реплицируются не в
S
-
фазе, а в начале
анафазы митоза.



Для удержания хроматид друг с другом центромерные участки
(содержащие
CpG
) метилируются, что способствует более прочному
связыванию цепей друг с другом.

Значение метилирования

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

II.
Метилирование

Аденина

(
5’
-
GA
me
TC
-
3’)
:


1.
Защита собственной (бактериальной) ДНК от расщепления
собственными
эндонукеазами

рестрикции (
рестриктазами
).


Бактериальные
ДНК
-
метилазы

функционируют совместно с бактериальными
эндонуклеазами

рестрикции

(
ректриктазами
).


Система из этих двух ферментов называется
системой
модификации
-
рестрикции
.

Оба этих фермента являются
сайт
-
специфическими
.

[
сайт


олигонуклеотидная

последовательность
]




Рестриктазы



это сайт
-
специфические
эндодезоксирибонуклеазы
,
вносящие
двухцепочечные

разрывы в ДНК в специфических
олигонуклеотидных

последовательностях (сайтах) по 4
-
6 нуклеотидов.




ДНК
-
метилазы

бактерии распознают тот же сайт (что и
рестриктаза
) и
метилируют

в нем нуклеотид (например,
аденин
).

!!!
Метилирование

сайта рестрикции ДНК
-
метилазой

предупреждает
его «разрезание»
рестриктазой
!!!


Значение метилирования

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

II.
Метилирование Аденина (
5’
-
GA
me
TC
-
3’)
:


В целом, функция системы модификации
-
рестрикции


защита
бактерии от чужеродной ДНК (например, вирусной).


Значение метилирования

Бактерия

СН
3

СН
3

СН
3

СН
3

СН
3

СН
3

СН
3

СН
3

СН
3

СН
3

СН
3

СН
3

СН
3

М

Р

М

Р

ДНК
-
метилаза

Рестриктаза

Бактериофаг

ДНК бактериофага
(
НЕметилирована
)

CH
3

CH
3

CH
3

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

II.
Метилирование Аденина (
5’
-
GA
me
TC
-
3’)
:


В целом, функция системы модификации
-
рестрикции


защита
бактерии от чужеродной ДНК (например, вирусной).


Значение метилирования

ИТОГ 1: ДНК
-
метилаза

первой столкнулась с вирусной ДНК
→ бактерия
«заболела» → продукция бактериофага → смерть бактерии.

Бактериофаг становится
устойчивым

ко всем бактериям
данного штамма
.

ИТОГ 2:
Рестриктаза

первой столкнулась с вирусной ДНК
→ расщепление
вирусной ДНК → бактерия живет.

Вероятность первостепенной встречи с ДНК бактериофага

ДНК
-
метилазы ~ в 10
5

раз меньше, чем рестриктазы.

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

II.
Метилирование

Аденина

(
5’
-
GA
me
TC
-
3’)
:

2. Участие в
MisMatch
-

(
МисМэтч
-
)
репарации ошибок репликации.

При репликации могут возникнуть ошибки в новой (синтезируемой) цепи.
Ошибка


нарушение структуры ДНК.

Метилированные

5’
-

GATC


3’


это «метки» родительской цепи (т.е.
правильной цепи).

Схема работы репарационной системы:


Значение метилирования

Ошибка
репликации

нарушение
структуры ДНК

распознавание дефекта
репарационной
системой (
Реп С
)

движение
Реп С

от точки
дефекта до ближайшего
5’
-
GATC
-
3’

повтора

определение цепи с
неметилированным


5’
-
GATC
-
3’

(новая цепь)

внесение в
GATC
новой цепи
одноцепочечного

разрыва
(
эндонуклеазная

активность)

гидролиз цепи в обратном
направлении: от места

разрыва до места ошибки
(
экзонуклеазная

активность)

застраивание бреши в обратном
направлении: от места
исправленной ошибки до места
разрыва (ДНК
-
полимеразная
активность)

восстановление
фосфодиэфирной
связи ДНК
-
лигазой

MisMatch
-

репарация

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

Репарация ДНК

Репарация



исправление химических повреждений и
разрывов в молекулах ДНК, повреждённой при репликации
или в результате воздействия физических или химических
факторов.

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

Откуда повреждения ДНК ?


Действие физических факторов:


-

облучения (УФ, ИК,
γ
);

-

самопроизвольные локальные изменения температуры.


Химические факторы:

-

свободные радикалы (вследствие окислит. стресса или
физич.воздействия);

-

химические мутагены.


Биологические факторы:

-

ошибки ДНК
-
полимеразы при репликации.

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

Типы повреждений ДНК

1. Повреждение оснований:


-

гидролитическое выщепление оснований (спонтанно, пентозо
-
фосфатный остов сохраняется). Потеря = 50 тыс. оснований в
сутки.


-

дезаминирование оснований:


Цитозин → Урацил


5
-
метилцитозин → Тимин


Аденин → Гипоксантин

-

димеризация оснований (наример, димеризация
T=T
);


-

алкилирование оснований:


гуанин → 6
-
О
-
метилгуанин


2. Повреждения цепей ДНК:


-

одноцепочечные разрывы;


-

поперечные сшивки (ковалентное сшивание):


ДНК
-
ДНК или ДНК
-
Белок.

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

Типы репараций

Эксцизионная

(
excision


вырезание)

Прямая

Пострепликативная

NER

(nucleotide excision repair)
вырезание поврежденных
нуклеотидов

BER

(base excision repair)
вырезание азотистых
оснований

Деметилирование


нуклеотидов

Фоторепарация

(
фотореактивация
)


димеров

T=T

ДНК
-
фотолиаза

(активируется
λ
=300
-
500
нм
)

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

NER

(nucleotide excision repair)

вырезание поврежденных нуклеотидов


Состав репарационной системы:


Эксцизионная

нуклеаза (
эксцинуклеаза
)
-

ЭкН
;


ДНК
-
полимераза (
репарирующая
);


ДНК
-
лигаза
.

Схема работы:

ЭкН

распознает поврежденный участок →
ЭкН

гидролизует

фосфодиэфирные связи с двух сторон от повреждения (вырезание
повреждения) →
полимераза

застраивает
одноцепочечную

брешь

лигаза

восстанавливает фосфодиэфирную связь.


Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

BER

(base excision repair)

вырезание азотистых оснований

Состав репарационной системы:


ДНК
-
гликозилазы
;


АР
-
эндонуклеазы

(АР


ap
urinic
/
ap
yrimidinic

site
);


АР
-
лиазы
;


ДНК
-
полимераза (
репарирующая
)


ДНК
-
лигаза
.

Схема работы:

ДНК
-
гликозилаза

находит
AP
-
сайт (повреждение) и отщепляет от
дезоксирибозы

поврежденное
азотист.основание



оставшийся
пентозо
-
фосфатный

остов вырезается
АР
-
эндонуклеазой

(с 5

-
конца) и АР
-
лиазой

(с 3

-
конца) →

полимераза застраивает брешь →

лигаза

восстанавливает фосфодиэфирную связь.

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

Реакция:
O
6
-
алкил(метил
-

или этил
-
)гуанин →
Гуанин

Фермент:
O
6
-
алкилгуанинтрансфераза (
AGT
)


Схема работы:

O
6
-
алкилгуанин +
AGT



перенос метильной или этильной группы с O
6
-
алкилгуанина на один из остатков цистеина
AGT




Гуанин + инактивация

алкилированного
AGT

Деметилирование

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин

Реакция: репарация димеров тиминов (Т=Т)

Фермент: ДНК
-
фотолиаза


Схема работы:

ДНК
-
фотолиаза распознает Т=Т →


поглощение фотолиазой квантов света (
λ
=300
-
500 нм)


расщепление двух ковалентных связей между тиминами.

Фоторепарация

Правообладатель
-

В.Н.
Рогожин


Приложенные файлы

  • pdf 5877103
    Размер файла: 745 kB Загрузок: 4

Добавить комментарий