К1_05 СРСП1 микроскопия

Ф КГМУ 4/3-06/04
ПП КГМУ 4/04


Карагандинский государственный медицинский университет
Кафедра медицинской биофизики и информатики











Методические рекомендации для самостоятельной работы студентов
под руководством преподавателя


Тема: Закономерности поглощения света биологическими системами. Спектрофотометрические методы исследования. Взаимодействие электромагнитных волн с веществом.
Дисциплина: OODO12 МВ 1112 медицинская биофизика
Специальность: 5В130100-«Общая медицина»
Курс: I
Составитель: Коршуков И.В., Мхитарян К.Э.
Время (продолжительность): 2 часа.

























Караганда 2015


Обсуждены и утверждены на заседании кафедры
Протокол № __ от «__» ______20__
зав. кафедрой _______________ Койчубеков Б.К.

Тема: Закономерности поглощения света биологическими системами.
Подтема: Специальные приемы микроскопии биологических объектов.
Цель: Студент должен иметь возможность выбирать способ микроскопии, наиболее подходящий для данных условий изучения биологических объектов.
Задачи обучения:
а. Описать основные свойства света, как электромагнитной волны.
б. Описать поведение света в простой оптической системе, состоящей из одной линзы.
в. Описать оптическую систему световой микроскопии.
г. Описать оптические системы других типов микроскопии.
Форма проведения: Метод малых групп
Задания по теме: Выберите 5 основных методов микроскопии в медицинской области, основанных на различных физических явлениях. Объясните свое решение. Опишите каждый метод в 4 пунктах:
Цель этого метода
Физические основы этого метода, в данном случае объяснить, как свет взаимодействует с образцом и проходит через оптическую систему микроскопа, схематический вид следования лучей.
Ограничения этого метода
Преимущества и недостатки по сравнению с другими методами, имеющими такое же назначение (следует отметить объект сравнения).
Раздаточные материалы: Нет.
Литература:
Основная:
Микроскопические методы исследования: [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]
Световая микроскопия. [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]
Микроскоп и микроскопические методы исследования. [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]
Методы световой и электронной микроскопии. [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]
8. Контроль:
1. Какие преимущества вы можете назвать для световой микроскопии.
2. Какие недостатки вы можете назвать для световой микроскопии.
3. Какой метод микроскопии является самым популярным? Поясните свой ответ.
4. Какой метод микроскопии может быть использован для визуализации без окрашивания, изначально прозрачного объекта? Поясните свой ответ.
5. Какой метод может быть использован для визуализации генетического материала в клетке? Поясните свой ответ.

Обратная связь.


1 совершенно несогласен
2 несогласен
3 не знаю
4 согласен
5 совершенно согласен

1
Это занятие развило мои навыки по решению проблем.






2
Для успешного прохождения этого занятия от меня требовалась только хорошая память.






3
Это занятие развило моё умение работать в команде.






4
Данное занятие улучшило мои аналитические способности.






5
Данное занятие улучшило мои навыки изложения письменного материала.






6
На занятии требовалось глубокое понимание материала.






7
Преподаватель был более заинтересован в проверке того что я запомнил, чем того что я понял.






Если в ходе занятия вы не смогли выполнить задание или получили неудовлетворительную оценку ответьте на следующий вопрос:
Каковы причины невыполнения задания?
А) недостаточная активность участников малой группы
Б) отсутствие или недостаточное количество учебной литературы
В) недостаток базовых (школьных) знаний по физике
Г) недостаточно усилий приложено для выполнения задания
Д) чрезмерная сложность задания
Е) недостаток времени

ПРИЛОЖЕНИЕ
ДИДАКТИЧЕСКИЙ БЛОК
Микроскоп, ход лучей, увеличение
Оптическая система простейшего микроскопа состоит из двух линз: объектива и окуляра. Окуляр применяется также в зрительной трубе рефрактометра и спектроскопа, в поляриметре и других оптических приборах.
В простейшем виде окуляр - это собирающая линза, которую помещают перед глазом так, чтобы ее задний главный фокус примерно совпадал с оптическим центром глаза, а рассматриваемый предмет находился несколько ближе ее переднего фокуса (рис. 1). Лучи, исходящие из точек наблюдаемого в окуляр предмета (например, из точки Б), преломляются в линзе и выходят из нее расходящимся пучком. Попадая в глаз, лучи преломляются в его средах и пересекаются на сетчатой оболочке глаза, образуя действительное изображение предмета. Глаз относит это изображение к точкам пересечения продолжения лучей, попадающих в глаз. Совокупность этих точек называют мнимым изображением предмета (точка Б'), Поэтому можно сказать, что глаз «видит» мнимое изображение предмета, образованное с помощью окуляра и увеличенное по сравнению с предметом. Удобным при этом является то, что окуляр дает прямое изображение.


Рис. 1
Рассмотрим ход лучей через окуляр и глаз при построении изображения от предмета в виде стрелки А Б (рис. 1). Луч, исходящий из точки Б параллельно главной оси, после преломления в линзе Л пройдет через оптический центр О' глаза, который по условию совпадает с задним фокусом линзы, и упадет на сетчатую оболочку глаза в точке Б", которая и является действительным изображением точки Б предмета.
По общему правилу точка изображения находится как точка пересечения по крайней мере двух лучей, исходящие из соответствующей точки предмета. Необходимость двух лучей обусловлена тем, что точка их пересечения определяет положение плоскости изображения. Если положение этой плоскости известно, то точка изображения может быть найдена как точка пересечения этой плоскости и хотя бы одного луча, исходящего из точки предмета, например луча, проходящего через оптический центр линзы. Подобные условия и имеют место в данном случае: для нормального глаза вследствие аккомодации плоскость изображения (независимо от расположения предмета) совпадает с центральной частью сетчатки. Поэтому точка изображения предмета может быть найдена как точка пересечения плоскости сетчатки и только одного луча, проходящего через оптический центр глаза, В данном случае так и определена точка Б'' изображения.
Для полноты картины на рис.1 изображен также ход и второго луча, который из точки Б пройдет через оптический центр линзы О и преломится в оптических средах глаза таким образом, что его пересечение с первым лучом произойдет в той же точке Б" на сетчатой оболочке.
Мнимое изображение (Б'А') находится на месте пересечения продолжения лучей, вступающих в глаз. Расстояние, на котором оно получается, зависит от того, насколько близко к фокусу окуляра расположен предмет. Если предмет находится в фокусе, то лучи из окуляра выходят параллельными, а изображение уходит в бесконечность и глаз наблюдает его при покое аккомодации.
При приближении предмета к линзе угол расхождения лучей, выходящих из окуляра, увеличивается и изображение получается ближе к линзе. В этом случае оно наблюдается в условиях аккомодации глаза - на расстоянии наилучшего зрения, равном 25 см.
Увеличение, которое дает окуляр, при этом почти не изменяется (в этом можно убедиться путем построения хода лучей). Поэтому расстояние, на котором глаз фиксирует мнимое изображение, не имеет особого значения и определяется только удобством наблюдающего.
Окуляр образует мнимое изображение, которое нельзя измерить непосредственно, но о величине которого можно судить по углу зрения. В связи с этим вводят понятие об угловом увеличении, которое дает окуляр (или вообще оптический прибор).
Угловое увеличение у численно равно отношению угла зрения (пр на предмет, когда он рассматривается с помощью оптического прибора, к углу зрения (гл на этот же предмет при наблюдении его невооруженным глазом:

Угловое увеличение показывает, во сколько раз величина изображения предмета на сетчатке глаза в первом случае больше, чем во втором.
Угол зрения глаза, вооруженного окуляром, есть угол (' (рис. 1). Из (О'Ов, учитывая, что Ов=АБ=d, находим тангенс угла (', равный отношению величины d предмета к фокусному расстоянию f линзы: tg ('=d/f. Как видим, расстояние до мнимого изображения в формулу не входит. При наблюдении невооруженным глазом предмет располагается на расстоянии наилучшего зрения s. В этом случае тангенс угла зрения ( определяется как отношение величины d предмета к расстоянию наилучшего зрения tg(=d/s. Тогда угловое увеличение окуляра (по малости углы зрения можно заменить их тангенсами)

Увеличение окуляра равно отношению расстояния наилучшего зрения к фокусному расстоянию линзы. (Формула тем точнее, чем меньше f по сравнению с s.). Окуляр может дать увеличение до 20-25 раз.

Рис. 2
В микроскопе предмет АБ (рис. 2) помещается несколько дальше переднего главного фокуса объектива Об. При этом плоскость промежуточного изображения A'Б' находится за двойным фокусным расстоянием объектива. Окуляр Ок располагается так, чтобы эта плоскость находилась несколько ближе к линзе, чем ее передний фокус. Ход лучей через объектив строим по общим правилам. Ход лучей через окуляр и глаз строим аналогично предыдущему случаю, рассматривая изображение А'Б' как предмет, расположенный перед окуляром. Для этого лучи, образующие точку Б' промежуточного изображения, надо продолжить до пересечения g главной плоскостью окуляра в точках l и l'. Через оптический центр О' окуляра проводятся побочные оси, параллельные этим лучам, до пересечения в точках m и n с фокальной плоскостью MN окуляра, которая в данном случае совпадает с главной плоскостью глаза. Рассматриваемые лучи должны пройти через эти точки как через фокусы для лучей соответствующего направления.
Аналогичное построение выполняется и для нахождения точек пересечения этих лучей с фокальной плоскостью глаза Фгл, на пересечении их за фокальной плоскостью и находится точка Б”' изображения на сетчатке. Точка Б" мнимого изображения найдется как точка пересечения продолжения отрезков lm и l'n рассматриваемых лучей.
Угловое увеличение микроскопа (м численно равно произведению линейного увеличения объектива (об и углового увеличения окуляра

Линейное увеличение линзы равно отношению расстояний от ее оптического центра до изображения (b) и до предмета (а):(=b/a. Применяя эту формулу к объективу микроскопа, можно считать расстояние а от предмета до объектива равным фокусному расстоянию объектива: а=fо6. Расстояние от объектива до изображения равняется сумме фокусного расстояния объектива fоб и так называемой оптической длины тубуса L0 (расстояние между задним главным фокусом объектива и передним главным фокусом окуляра): b=fоб+L0 или, пренебрегая фокусным расстоянием объектива по сравнению с оптической длиной тубуса (последняя обычно в десятки раз больше), b(L0. Тогда увеличение объектива (об=b/a=L0//fоб. Следовательно, увеличение микроскопа

Эта формула тем точнее, чем меньше fоб по отношению к L0. Увеличения объектива и окуляра указываются на их оправе.
Разрешающая способность микроскопа
Несмотря на то, что увеличение оптического микроскопа может быть сделано достаточно большим, возможность различения мелких деталей предмета ограничивается дифракционными явлениями. При прохождении света через мельчайшие детали предмета изображение их вследствие дифракции может терять резкость, может возникнуть нарушение геометрического подобия изображения предмету и, наконец, возможно полное исчезновение изображения. Поэтому, например, в оптическом микроскопе невозможно видеть фильтрующиеся вирусы, отдельные белковые молекулы и т. п.
Свойства оптической системы давать раздельное изображение двух близко расположенных светящихся (или освещенных) точек называют разрешающей способностью системы и характеризуют пределом разрешения, т. е. наименьшим возможным расстоянием между этими точками. Чем меньше предел разрешения, тем выше разрешающая способность оптического прибора.
Применяя это понятие к условиям микроскопирования биологических объектов, можно считать, что предел разрешения обусловливает наименьшую величину тех структурных деталей, которые могут различаться в препарате.
Разрешающая способность микроскопа в целом определяется разрешающей способностью объектива, в который непосредственно входят лучи света, дифрагировавшие на деталях предмета. Основным элементом, обусловливают им разрешающую способность объектива, является его апертурный угол.
Рассмотрим образование с помощью объектива изображения светящегося отверстия S достаточно малого диаметра d, на которое падает пучок параллельных монохроматических лучей (рис.3). Проходя через отверстие, свет испытывает дифракцию. Объектив собирает дифрагировавшие лучи н в сопряженной плоскости образует изображение S' отверстия. При этом возможны два случая. Во-первых, когда апертурный угол объектива ( больше угла ( дифракции лучей или равен ему ((
·(), тогда все дифрагировавшие лучи принимают участие в образовании изображения (рис. 3,а); в этом случае изображение будет геометрически подобно предмету. Во-вторых, когда апертурный угол ( объектива, ограничивающий конус входящих в него лучей, меньше угла ( дифракции лучей ((<(), тогда не все исходящие из отверстия лучи принимают участие в образовании изображения (рис. 3,б) в этом случае можно ожидать, что изображение не будет полностью подобно предмету. Степень нарушения подобия будет зависеть от того, какая часть дифрагировавших лучей не попадает в объектив и не принимает участия в образовании изображения.

Рис 3
Угол ( дифракции лучей тем больше, чем больше длина волны
· и чем меньше диаметр d отверстия, т.е. (~
·/d. Тогда в предельном случае, когда (=(, между апертурным углом (, длиной волны
· и диаметром отверстия d можно установить аналогичное соотношение (~
·/d, откуда d~
·/(. Таким образом, диаметр d отверстия, при котором сохраняется подобие изображения предмету, может быть тем меньше, чем короче длина волны к и чем больше апертурный угол ( объектива.
Перенося рассуждения на условия микроскопирования, можно считать, что диаметр d отверстия соответствует наименьшему размеру структурных деталей препарата, т.е. приравнять его пределу разрешения z объектива микроскопа z=d. Тогда можно сказать, что предел разрешения объектива z будет тем меньше, чем короче длина волны
· света, падающего на предмет, и чем больше апертурный угол ( объектива.
В теории Аббе в качестве микроскопируемого предмета рассматривается дифракционная решетка (рис.4), которая освещается пучком перпендикулярно падающих на нее параллельных монохроматических лучей. Лучи, претерпевшие дифракцию на щелях решетки, собираются объективом Л в его фокальной плоскости, образуя систему дифракционных максимумов (0,1 и 1’, 2 и 2', 3 и 3' и т.д.). За фокальной плоскостью лучи, образующие максимумы различных порядков, расходятся и, пересекаясь между собой в сопряженной плоскости, дают на экране изображение решетки. Если в его образовании принимают участие лучи от всех максимумов (рис. 4,а), то изображение будет резким и геометрически подобным предмету.
Если с помощью диафрагмы Д уменьшать апертурный угол объектива (рис. 4,б), то лучи, образующие максимумы более высоких порядков, не попадут в линзу и не будут участвовать в образовании изображения. Изображение будет терять резкость и тем больше, чем меньшим будет апертурный угол. Если апертурный угол уменьшить так, что в линзу попадут только прямые лучи, образующие нулевой максимум (рис. 4,в), то экран будет равномерно освещен и изображения решетки не получится.
Как показал Аббе, для разрешения щелей в изображении дифракционной решетки необходимо, чтобы в образовании ее изображения участвовали лучи от максимумов нулевого и первого порядка хотя бы с одной стороны. Для этого направления лучей, образующих эти максимумы, должны быть в пределах апертурного угла объектива. Другими словами, апертурный угол объектива ( должен быть больше угла
·1 отклонения лучей, образующих максимум первого порядка, или в пределе равен ему: (
·
·1. Предел разрешения в этом случае может быть приравнен периоду решетки: z=d. Тогда, используя формулу дифракционной решетки d=
·/sin
·1 и подставляя в нее указанные величины, получим






Рис.4


т.е. предел разрешения численно равен отношению длины волны света к синусу апертурного угла объектива.
В более сильных микроскопах предмет освещается сходящимся пучком лучей, который образуется с помощью конденсора К. В этом случае вследствие концентрации света на небольшом участке предмета значительно повышается яркость изображения, а в связи с наличием лучей, падающих наклонно на предмет, улучшаются условия разрешения.
Пусть, например, пучок параллельных лучей падает на решетку под углом
·, равным апертурному углу
·, в таком случае (рис. 4) угол
·1 отклонения лучей, образующих максимум первого порядка, может быть приравнен удвоенному апертурному углу:
·1=2
·. В наших приближенных рассуждениях (рис. 4) это соответствует условию z=
·/2
·, а в теории Аббе формула для предела разрешения принимает вид

Дальнейшим усовершенствованием микроскопа явилось применение иммерсионного объектива. Так называют объектив, у которого пространство между наблюдаемым предметом и входной линзой заполняется жидкостью с показателем преломления, близким к стеклу, например глицерин (n=1,45) или монобромнафталин (n=1,65). При иммерсионном объективе, во-первых, значительно увеличивается яркость изображения и, во-вторых, повышается разрешающая способность микроскопа.

а) б)
Рис.5 Рис.6
Ход световых лучей показан сравнительно в простом («сухом») и иммерсионном объективах на рис. 6, на котором обозначено: П-препарат, С-покровное стекло, И-иммерсионная среда, О-фронтальная линза объектива и К-конденсор. При наличии между покровным стеклом и объективом воздуха (рис. 6,а) лучи, падающие на препарат под углом, большим предельного а, испытывают на границе стекла и воздуха полное внутреннее отражение и не попадают в объектив; отражение лучей происходит также и от передней поверхности объектива, на которую лучи падают под относительно большим углом.
При иммерсии свет от предмета до объектива проходит по оптически однородной среде и не дает потерь на отражение (рис 6,б). Это значительно повышает яркость изображения, что имеет существенное значение особенно для микроскопа с большим увеличением. (Для микроскопа с увеличением в 400 раз площадь изображения по сравнению с площадью предмета увеличивается в 160 000 раз, во столько же раз уменьшается его яркость по сравнению с яркостью предмета).
В иммерсионном объективе, где между предметом и объективом находится среда с показателем преломления n, длина волны
·n света, проходящего в объектив,
·n=
·/n, где
·-длина волны света в воздухе. Подставляя эти данные в формулу для предела разрешения, получим

Величина А=sin
· для сухого или An=n sin
· для иммерсионного объектива называется численной апертурой и для сухого объектива обозначается на его оправе вместе о увеличением.
Максимальный апертурный угол может быть порядка 70°, тогда для сухого объектива численная апертура А=sin 70° = 0,94, для иммерсионного - при n - 1,5 Ап = 1,5-0,94 = 1,4.
При освещении предмета белым светом можно считать X = 0,555 мкм (длина волны, к которой глаз наиболее чувствителен), тогда предел разрешения для сухого микроскопа при прямом освещении z =
·/A = 0,5 нм, при наклонном освещении z =
·/A = 0,3 нм и для иммерсионного объектива z =
· /2Ап = 0,2 нм.
Для того чтобы эти объекты были различимы также и глазом, увеличение
·м микроскопа должно быть не меньше величины, определяемой соотношением пределов разрешения глаза zгл и микроскопа zм:
·м
· zгл/zм = 75/(0,2 - 0,3) = 250 - 400.
Такое увеличение называют полезным увеличением микроскопа. Практически (с некоторым запасом) увеличение микроскопа берут равным
·м = (500- 1000)A, где А - численная апертура.
Дальнейшее повышение разрешающей способности оптического микроскопа достигается уменьшением длины волны света, с помощью которого производится исследование, например путем применения ультрафиолетового излучения. Для этого имеются специальные микроскопы с кварцевой оптикой, снабженные приспособлением для фотографирования наблюдаемых объектов.


Рис.7 внешний вид современного бинокулярного микроскопа

В настоящее время ограничения оптического микроскопа, обусловленные дифракцией света, потеряли свою остроту в связи с открытием электронного микроскопа, имеющего разрешающую способность на несколько порядков выше.
Конструкция микроскопа.
На рис 7 показан стереомикроскоп и пронумерованы его основные части:
1. Окуляры
2. Револьвер со сменными объективами
3. Объектив
4. Микровинт
5. Макровинт
6. Предметный столик
7. Источник света
8. Конденсор и диафрагма
9. Система крепления и перемещения препарата
Методы оптической микроскопии
Метод светлого поля и его разновидности
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]

Рис. 8. Зафиксированная окрашенная (Кумасси синий) клетка. Избирательное окрашивание белков цитоскелета.

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения. Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.
Метод косого освещения - разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.
Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд, костной ткани. Освещение препарата (от осветителя и полупрозрачного зеркала) производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.
Оптический, или световой микроскоп использует видимый свет, проходящий через прозрачные объекты, или отражённый от непрозрачных. Оптическая система из нескольких линз позволяет получить кажущееся увеличенное изображение образца. Полученное изображение можно наблюдать глазом (или обеими глазами, в бинокуляре), либо фотографировать, передавать на видеокамеру для оцифровки.
Некоторые специальные приемы оптической микроскопии.


Рис.9

1. Микропроекция и микрофотография. Мнимое изображение в микроскопе обусловлено тем, что промежуточное действительное изображение, образуемое объективом, располагается ближе переднего фокуса окуляра. Если это условие нарушить, например, передвинуть окуляр так, что изображение, которое дает объектив, окажется дальше фокусного расстояния окуляра (рис. 9), то последний будет давать действительное изображение, которое может быть спроецировано на экран или фотопленку. Окуляр при этом служит проекционной линзой. Аналогичные результаты можно получить, смещая весь тубус относительно предмета. Наконец, можно удалить окуляр и проецировать на экран или фотопленку действительное изображение, даваемое только объективом, хотя при этом будет реализовано значительно меньшее увеличение.
Наблюдение на экране действительного изображения предмета, полученного одним из указанных способов, называется микропроекцией. Микроскоп в этом случае ставят горизонтально и предмет освещают сильным источником света.
Фотографирование полученного таким образом действительного изображения называется микрофотографией. Обычно для этого употребляется специальная фотонасадка к микроскопу, которая (рис. 10) представляет собой фотокамеру, надеваемую на окулярный конец тубуса Т микроскопа М. Изображение предмета проецируется на плоскость расположения фотопластинки Ф. Насадка снабжена вспомогательным микроскопом с призмой П для наблюдения в процессе подготовки к съемке.

Рис.10 Рис.11
2. Определение величины предмета. Определение величины микроскопируемого предмета делается с помощью нанесенных на стеклянную пластинку масштабных шкал, называемых окулярный (рис. 11,а) и объектным (рис. 11,б) микрометрами.
Окулярный микрометр Мок помещают между линзами окуляра так, чтобы его шкала находилась в плоскости промежуточного изображения, образуемого объективом. В окуляр наблюдается изображение шкалы, совмещенное с изображением микроскопируемого предмета А'Б' (рис.12). Учитывая цену деления шкалы микрометра, можно определить размер этого изображения, даваемого объективом, а разделив полученные данные на известное увеличение объектива р - действительные размеры предмета.
Если цена деления окулярного микрометра неизвестна, то ее можно определить с помощью объектного микрометра с известной ценой деления (обычно это 0,01 мм). Объектный микрометр помещается на место препарата и в окуляр наблюдаются совмещенные изображения обеих шкал.
3. Метод темного поля. Используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции (конденсором тёмного поля).

Рис. 12 Рис. 13
Конденсор темного поля состоит из нескольких линз особой формы, образующих наклонные пучки света, которые освещают препарат, но затем приходят мимо объектива (рис. 13,б). Ход лучей через конденсор К, предмет П и объектив О при наблюдении в светлом поле показан на рис. 13,а. Аналогичный ход лучей при наблюдении в темном поле - на рис. 13,б. Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.
4. Фазово-контрастный метод.


Рис.14

Метод фазового контраста предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов (рис.14), невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе. Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости, которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.
Допустим, что в простейшем случае в однородной среде препарата П (рис. 15), освещенной пучком РР параллельных лучей, имеется точечный объект М, вызывающий дифракцию света. Лучи РР, прошедшие через среду, сходятся в главном фокусе F объектива и затем падают на экран Э расходящимся пучком. Лучи MN, образовавшиеся вследствие дифракции света на объекте М, падают на объектов расходящимся пучком и сходятся на экране в точке М', являющейся изображением объекта М. Между лучами Р и MN имеется некоторая разность хода, которая с помощью оптического устройства, называемого фазовой пластинкой, увеличивается примерно до половины длины волны. Вследствие этого в точке М' прямые лучи РР и дифрагировавшие MN интерферируют и взаимно гасятся. Поэтому изображение объекта М наблюдается затемненным на светлом фоне окружающей среды.

Рис. 15
Фазовая пластинка К представляет собой слой прозрачного вещества определенной толщины с определенным показателем преломления, имеющий форму кружка очень малого диаметра. Пластинка помещается в главном фокусе объектива. Таким образом, через фазовую пластинку проходят только лучи РР, которого и получают при этом дополнительную (по отношению к лучам MN) разность хода.
Для фазово-контрастной микроскопии применяют особые объективы, содержащие фазовую пластинку, и специальные конденсоры. Все эта детали устанавливаются в обычный биологический микроскоп.
5. Поляризационная микроскопия


Рис.16

Поляризационная микроскопия - это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов (рис.16), включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани (мышечная ткань и др.). Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор. Сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него). Эти изменения изучаются с помощью анализатора и различных оптических компенсаторов. Анализируя такие изменения, можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.


Рис.17

6. Метод интерференционного контраста
Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп (рис.17). Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой - мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором. Можно сказать, что метод интерференционного контраста сходен с методом фазового контраста - они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток и применяются во многих случаях именно с этой целью. Главное отличие интерференционной микроскопии от метода фазового контраста - это возможность измерять разности хода, вносимые микрообъектами. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта. К интерференционной микроскопии относятся также методы использования микроинтерферометров.


Рис.18

7. Метод исследования в свете люминесценции
Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов (рис.18), которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен - возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии, иммунологии и паразитологии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.

Рис. 19
8. Капилляроскопия. В клинике применяется метод наблюдения капилляров в коже у живого человека, называемый капилляроскопией. Наблюдение обычно производится в области ногтевой складки пальцев руки, где капилляры расположены горизонтально и относительно поверхностно. Для просветления кожи на нее наносят каплю глицерина. С помощью осветителя О (рис. 19,а) обеспечивается сильное боковое освещение. Свет проникает на некоторую глубину просветленного слоя кожи, и в микроскопе М (в отраженном свете) наблюдаются петли капилляров (рис. 19,б), которые можно сфотографировать.
9. Счет форменных элементов крови. С помощью микроскопа производится счет форменных элементов крови. Для этого применяются специальные счетные камеры. Счетная камера (рис. 20,а) представляет собой тонкую стеклянную пластинку с круглым плоским углублением, на дне которого нанесена измерительная сетка (рис. 20,б). Камера укрепляется на предметном стекле.
а)[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]б)[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
Рис. 20
В счетную камеру помещают каплю разведенной в 100 раз крови. Камеру закрывают сверху хорошо протертым покровным стеклом и ставят на предметный столик микроскопа. Сосчитывают форменные элементы в нескольких квадратах сетки, находят среднее, умножают его на переходный коэффициент и получают количество тех или иных элементов крови, отнесенное в 1 мм3 ее объема.








Специальные приемы микроскопии биологических объектов.

13PAGE 15


13PAGE 141015




Метод фазового контраста. Инфузория туфелькаМетод интерференционного контраста Заголовок 1 Заголовок 2 Заголовок 3 Заголовок 4 Заголовок 5 Заголовок 6 Заголовок 7 Заголовок 8 Заголовок 915

Приложенные файлы

  • doc 5831723
    Размер файла: 744 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий