апоптоз растительных клеток

Жизнь любого многоклеточного организма сопровождается практически ежедневной гибелью в нем многих клеток. В этом могут быть повинны самые разнообразные неблагоприятные факторы и агенты среды, и такая гибель клеток обычно имеет выраженный случайный характер. С другой стороны, судьба многих клеток и даже некоторых отдельных тканей в организме строго предопределена, и их смерть генетически обусловлена, она изначально закодирована в геноме, является обязательным условием и составляющей онтогенеза и реализуется строго на определенном его этапе. Таких примеров в биологии много, и наиболее яркими и хорошо известными из них являются, например, гибель клеток и тканей при эмбриогенезе и морфогенезе животных (утрата хвоста у бесхвостых амфибий, метаморфоз насекомых, дегенерация мышечных тканей и другие). Такую генетически предопределенную гибель клеток уже давно называли нормальной физиологически естественной смертью или запрограммированной гибелью и ее довольно детально исследовали и подробно описали уже относительно давно. Однако, даже до недавнего времени существование запрограммированной гибели клеток (ЗГК) часто не только игнорировали, но иногда и вовсе не признавали, подобно тому как существование биологических часов и генов смерти вообще считались абсурдным. Особенно ярко и отчетливо значение естественной генетически контролируемой гибели клеток в регуляции популяций животных клеток и в онтогенезе было продемонстрировано и подчеркнуто в одной из работ английских эмбриологов. В статье детально описаны специфические морфологические черты клеток и тканей, вовлекаемых в этот активный наследственный процесс, названный апоптозом, и показано, что апоптоз как естественная генетически ЗГК является чрезвычайно распространенным феноменом. Термин апоптоз в переводе с греческого означает опадение (подобное опадению лепестков и листьев у растений). Нужно отдавать отчет в том, что наряду с апоптозом как генетически запрограммированной терминальной фазой клеточной дифференцировки у растений, существуют и другие процессы ЗГК, которые происходят под влиянием факторов среды (патогены, химические и физические воздействия в результате активации внутренних механизмов запрограммированного «самоубийства» клетки. Следовательно термин «запрограммированная гибель» выглядит гораздо шире, чем собственно апоптоз.
Наряду с ЗГК существует и запрограммированная гибель целого организма и отдельных органов. В. П. Скулачев предложил называть эти процессы соответственно феноптозом и органоптозом. Феноптоз существует у разных животных и растений. Особенно ярко он проявляется у тихоокеанских лососей (горбуша, нерка и др.): после выметывания половых продуктов все особи этих видов рыб погибают. Это происходит на фоне резкого увеличения содержания кортикостероидных гормонов и резкого деметилирования ДНК практически во всех тканях гибнущей рыбы. Несомненно, в запуске феноптоза исключительная роль принадлежит половым гормонам: если у нерки удалены гонады, то такая рыба не погибает и продолжительность ее жизни увеличивается в несколько раз. Феноптоз отмечен и в растительном мире: по этому механизму заканчивают в норме жизнь все монокарпические растения, в том числе и злаки. Особенно драматично выглядит феноптоз у растений бамбука (корневищный злак): после единственного и синхронного в жизни цветения и формирования относительно мелких (по отношению к массе растения) семян погибает вся плантация, иногда гигантская, этого растения. Невольно напрашивается мысль о том, что феноптоз у растений подобно феноптозу у животных контролируется гормонами, запускающими гены запрограммированной смерти. Поэтому гормон цветения (идея флоригена принадлежит М.Х.Чайлахяну или соответствующие комплексы природных регуляторов роста растений, индуцирующих цветение, могут оказаться и гормонами феноптоза. Особый интерес представляет вопрос о соотношении и взаимозависимости феноптоза, органоптоза и апоптоза. Легче всегобыло бы выстроить цепочку, например, так: апоптоз органоптоз феноптоз. В начале этой цепи В.П.Скулачев помещает еще и митоптоз (запрограммированная гибель митохондрий). Стрелки в этой цепи намеренно не приведены. Безусловно, обозначенная схема событий иногда выглядит довольно убедительно и обосновано. Так, например, массированный наследственный апоптоз нейронов (болезнь Альцгеймера) причина гибели всего организма. Предполагается также, что старение и в конечном итоге смерть являются следствием массированного митоптоза и накопления погибших клеток. С другой стороны, связи между этими процессами могут оказаться гораздо сложнее и менее предсказуемыми. На самом деле, не исключено, что органоптоз в одном органе (например, колеоптиль пшеницы) может запускать апоптоз отдельных клеток в другом (лист) и наоборот.
Несмотря на то, что у растений уже давно подразумевалось существование апоптоза, изучение морфологических черт и молекулярных механизмов апоптоза у этих организмов очень сильно отставало и отстает от чрезвычайно интенсивного и всестороннего исследования апоптоза у животных. Во многом это объясняется, во-первых, значительно большим удельным весом мировой биохимии животных по сравнению с биохимией растений вообще и, во-вторых, громадным интересом к клиническим исследованиям апоптоза. Это связано прежде всего с выявлением ключевой роли нарушений апоптоза в проявлениях самых разнообразных и многочисленных заболеваний человека, в том числе и при онкогенезе. До недавнего времени оставалось неизвестным вообще как проявляется апоптоз у растений. Сегодня создается впечатление, что апоптоз у растений довольно сходен с апоптозом у животных. Причем, отдельные важные компоненты апоптозной цепи в животной и растительной клетках довольно часто могут быть даже взаимно заменяемыми вплоть до того, что изолированные растительные ядра могут подвергаться апоптозу в бесклеточной системе из животных клеток и наоборот. В клетках растений Arabidopsis thaliana, гороха и риса обнаружен ген гомологичный животному гену dad1, который защищает клетки от апоптоза. Активность этого гена, как и противостояние апоптозу резко уменьшаются при старении растения; это наблюдалось в стареющих лепестках гороха и при обезвоживании семян. После введения этого гена в чувствительные к температуре мутантные клетки tsBN7 хомяка, у которых при определенной температуре индуцируется апоптоз, температурного запуска апоптоза у них больше не происходило. Тем самым, растительный белок, как и человеческий белок dadI, эффективно предотвращает апоптоз в клетках хомяка. Это свидетельствует о том, что механизмы апоптоза, и, в частности его супрессии, у животных и растений довольно сходны и весьма консервативны. Правда, указывается, что в геноме растений арабидопсиса, по-видимому, имеются два dad гена. Тем не менее, сведения об апоптозе у растений все еще очень фрагментарны, а многие черты и факторы этого явления удается обнаруживать в основном по аналогии с апоптогенными факторами, которые уже хорошо известны для животных клеток. Как и у животных, апоптоз у растений сопровождается чередой характерных структурно-морфологических изменений клетки: происходит выраженная конденсация хроматина с последующим распадом ядра, клеточная мембрана становится пузырчатой, вся цитоплазма как бы вскипает, что называют «пляской смерти» (dance macabre), и образуются гигантские вакуоли. В большинстве случаев у растений разрушение тонопласта и вакуолизация цитоплазмы предшествуют разрушению ядра и митохондрий. В цитозоле апоптозных клеток растений отмечено резкое увеличение концентрации Са2+. В отличие от животных остовы апоптозных растительных клеток, как правило, не исчезают бесследно из-за прочных клеточных стенок, они составляют обычно основу для образования сосудистых пучков и аэренхимы у растений. В клетках интактных растений типичные для апоптозных животных клеток так называемые «апоптозные тела» обычно не выявляются, однако подобные им сферические фрагменты протопластов наблюдаются при старении культуры изолированных растительных клеток. На начальных этапах индукции апоптоза в протопластах табака конденсация хроматина, также как и связывание аннексина V, свидетельствующее о сигнальной функции обращенных наружу остатков фосфатидилсерина, могут быть обратимыми. На ранних этапах апоптоза происходит также разрушение цитоскелета. Обнаружено, что в апоптозных клетках колеоптиля пшеницы вакуолярная мембрана впячивается внутрь вакуоли и увлекает за собой цитоплазму с интактными клеточными органеллами, затем эти выпячивания отшнуровываются, и в результате в вакуоли возникают везикулы (пузырьки) с однослойной вакуолярной мембраной (рис. 1), в которых активно функционируют митохондрии.


Рис. 1. Апоптозная клетка паренхимы апикальной зоны колеоптиля 8-дневного этиолированного проростка пшеницы. Образующийся вакуолярный везикул, содержащий активные митохондрии с интенсивным синтезом мтДНК, показан
стрелкой.

Тем самым, происходит некое дополнительное обособление определенной части митохондрий от ядра. Эти везикулярные митохондрии интактны, они активно потребляют кислород, по набору цитохромов не отличаются от свободных митохондрий и их главной отличительной чертой является чрезвычайно интенсивный синтез тяжелой (( = 1, 718 г/см3) митохондриальной ДНК (мтДНК). Смысл такого поведения митоходрий и резкого накопления мтДНК в предсмертной клетке пока еще не ясен. Не исключено, что апоптозный распад хроматина поставляет ядерный материал для безудержной репликации мтДНК в вакуолярных везикулах. Неизвестна и любопытна дальнейшая судьба этой мтДНК. Может быть, избыточная, образовавшаяся при апоптозе мтДНК как-то способна переходить в соседние клетки. Значительное увеличение содержания мтДНК и массы митохондрий на фоне остановки репликации яДНК происходят также при старении животных и человека. Отмечено, что при инкубации in vitro в присутствии H2O2 количество мтДНК в фибробластах человека и масса митохондрий увеличиваются в зависимости от концентрации H2O2 .
Заметная апоптозная деградация хроматина происходит ступенчато под действием индуцированных, в частности каспазами (см. ниже), эндонуклеаз, которые сначала атакуют хроматин в областях относительно протяженных розеточных петель (доменов) с высвобождением крупных 50-300 kb фрагментов. Это отчетливо наблюдалось у растений табака при гиперчувствительном ответе на инфекции, при апоптозе клеток эндосперма в развивающейся зерновке кукурузы и пшеницы и при холодовом стрессе в BY-2 клетках табака. Затем наступает черед межнуклеосомной фрагментации ДНК, крупные фрагменты хроматина атакуются эндонуклеазами в области межнуклеосомных спейсеров, которые по сравнению с ассоциированной с октамерами гистонов нуклеосомной ДНК более доступны действию эндонуклеаз. В результате высвобождаются фрагменты хроматина с длиной ДНК в них около 180 пар нуклеотидов. Это происходит в стареющем колеоптиле пшеницы (рис. 2), в эндосперме формирующейся зерновки кукурузы и пшеницы, в эндосперме семян клещевины при прорастании, в культуре стареющих клеток моркови, в стареющих растених арабидопсиса, при ксилогенезе и дифференцировке сосудистых элементов у разных растений, в том числе у растений цинии и ее клеточных культур, в семядолях огурца после теплового шока, в клетках табака при холодом стрессе, в алейроновом слое ячменя при прорастании, в развивающихся пыльниках ячменя
·, при старении плодолистика у гороха, при действии викторина на растения овса, при индуцированном опылением старении лепестков петунии и под влиянием разных патогенов у самых различных растений. При электрофоретическом разделении в агарозном геле такая ДНК выглядит в виде некой лестницы (см. рис. 2).
1 2 3 4 5 6

Рис. 2. ДНК из колеоптилей срезанных проростков. 1, 2, 3, 4, 6 – 6$дневные проростки, выросшие в воде, срезаны и проинкубированы в течение 48 ч в присутствии 105 М фитогормонов таких, как 1) АБК; 2) ауксин 2,4-Д; 3) 6-бензиламинопурин; 4) гиббереллин. 5) ДНК из колеоптилей интактных 8-дневных проростков, выросших в воде (контроль); 6) ДНК из колеоптилей 6-дневных контрольных проростков, которые после срезания еще инкубировали в воде в течение 48 ч.

При некрозе такая лестница не обнаруживается: в некротических клетках и тканях ДНК очень быстро и хаотично деградирует. Выявление такой лестницы является одним из наиболее надежных способов обнаружения и доказательства апоптоза. Существуют и другие, в том числе и цитологические методы обнаружения апоптозной деградации (фрагментации) ДНК. В частности, для этой цели широко используется так называемая TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end-labeling) процедура. В ее основе лежит флуоресцентное мечение высвобождающихся при деградации ДНК множественных 3’-OH концов. Однако, довольно часто бывает так, что по характерной измененной морфологии клетка явно подвержена апоптозу, а TUNEL-процедура его не выявляет. Это зависит от стадии апоптоза; если он зашел уже довольно далеко, гидролиз ДНК может происходить с образованием 5’-OH и 3’-фосфатных концов, которые не обнаруживаются этим методом. С другой стороны, на определение апоптоза этим методом могут накладываться и неиндуцированные апоптозом однотяжевые разрывы (дефекты) ДНК, часто множественно возникающие при воздействиии разных факторов на клетку и подвергающиеся обычно последующей репарации. Поэтому, как правило, наиболее надежно апоптоз детектируется путем оценки общей цитологической и биохимической картины с выявлением специфических маркеров апоптоза, среди которых межнуклеосомная фрагментация ДНК занимает ведущее место. В отличие от некоторых обратимых начальных стадий апоптоза у растений, такая фрагментация ДНК является уже одной из терминальных и необратимых стадий апоптоза, за которой следует дальнейшая быстрая, уже относительно неспецифическая и глубокая деградация ДНК нуклеазами. Как и у животных, при апоптозе у растений сильно активируются разные «терминальные» ДНК-азы, атакующие как одно - так и двутяжевые участки ДНК и активируемые Ca2+, содержание которого в апоптозных клетках растений обычно значительно увеличивается. Выделены и описаны cДНК, кодирующие ДНК-азы, которые принимают участие в терминальной деградации ДНК в эндосперме ячменя и во время превращения мезофильных клеток цинии в сосудистые структурные элементы. Предполагается, что с одной стороны, такая интенсивная деградация ДНК необходима и важна для того, чтобы «неправильная» ядерная ДНК из апоптозной клетки уже не могла быть перенесена в другие клетки, а с другой стороны, это служит эффективным путем использования пластического (нуклеинового) материала другими нормально функционирующими клетками в развивающихся органах (тканях) растения. Запуск апоптоза в растениях контролируется самыми различными факторами и зависит от функционального (физиологического) состояния растения. В частности, иногда апоптоз в клеточной культуре вызывается добавлением среды из-под старых клеток того же или иного вида растения. У растений, как и у животных, на клеточной мембране имеются соответствующие рецепторы, воспринимающие сигналы к апоптозу. Определенная роль при запуске апоптоза признается за арабиногалактановыми белками. Например, так называемый реактив Ярива, связывающийся с обогащенными оксипролином сильно гликозилированными арабино-галактановыми белками растений, индуцирует типичный апоптоз в суспензии клеток арабидопсиса. Индуцированный при этом апоптоз выявлен по характерным цитологическим признакам, появлению свободных 3’-OH групп в ДНК хроматина (TUNEL-метод) и по межнуклесомной фрагментации ДНК. Таким образом, арабино-галактановые белки на границе клеточная мембранаклеточная стенка могут как-то участвовать в индукции апоптоза у растений. Одним из возможных триггеров апоптоза у растений при ксилогенезе может, по-видимому, выступать ген ted 2, кодирующий хиноновую оксидоредуктазу. Найдены гены, отвечающие за апоптоз женских клеток при формировании мужских соцветий кукурузы, один из таких генов кодирует сходный с Ts2 белок, участвующий в образовании стероидов, которые могут служить сигнальными молекулами для апоптоза при половой дифференцировке клеток.
Старение листьев у других растений (двудольные) также происходит с участием апоптоза. Апоптоз выявлен в мезофильных клетках стареющих листьев растений Philodendron hastatum, Epipremnum aureum, Bauhiтia purpurea, Delonix regia и Butea monosperma; в молодых зеленых листьях этих же растений апоптоз не обнаруживается. До сих пор неясно передается ли апоптозный сигнал от клетки к клетке и как это осуществляется. Недавно описан новый ген H52 у растений томатов, который, кодирует некий фактор транскрипции белок HD-Zip и, по-видимому, контролирует распространение апоптозного сигнала в листьях растения. Подавление экспрессии этого гена приводит к разрегулировке контроля за распространением апоптоза. В отличие от контрольных у растений с репрессированным H52 геном апоптоз не ограничивается отдельными клетками, а захватывает весь лист, причем, это сопровождается активацией патоген-зависимых генов, сильным увеличением количества этилена и салициловой кислоты.
Гормональный Контроль Апоптоза.
Нет сомнений в том, что гормональные сигналы являются ведущими элементами в регуляции клеточной дифференцировки и всей программы развития, в том числе и запрограммированной гибели клеток у растений. В клетках цинии раневое поражение и определенное соотношение цитокинина и ауксина запускают апоптоз с формированием сосудистых элементов из мезофильных клеток. Интересно, что при добавлении к клеткам трипсина активируется Ca2+-зависимая нуклеаза и усиливаются деградация вакуоли и фрагментация яДНК; при этом секреция ингибируемой соевым трипсиновым ингибитором протеазы с молекулярной массой 40 кДа коррелирует с дифференцировкой сосудистых элементов. Межнуклеосомная фрагментация ДНК в клетках эндосперма злаков происходит после максимума образования в них этилена. «Гормон старения» этилен резко угнетает активность противостоящему апоптозу dad гена в стареющих лепестках гороха. Ингибирование образования этилена замедляет апоптозную фрагментацию ДНК у злаков, но не может предотвратить ЗГК в эндосперме. Под действием этилена, образующегося из этрела (2-хлорэтилсульфоновая кислота), индуцируется апоптоз в протопластах клеток моркови. Установлено, что индуцированная микотоксинами (AAL-токсин, фумонизин B-1) гибель клеток чувствительных растений томатов сопряжена с индукцией образования в них 1-аминоциклопропан-1-карбоксиловой кислоты (АЦК) и этилена; под действием этих токсинов в клетках растений усиливается образование мРНК АЦК$синтазы и АЦК-оксидазы. Продуцируемый Cochliobolus victоriae фитотоксин викторин вызывает типичный апоптоз в клетках листьев овса, этот процесс сопровождается интенсивным образованием этилена. Считается, что именно этилену принадлежит решающая роль в индуцируемом токсином апоптозе в листьях овса, поскольку ингибиторы синтеза этилена (тиосульфат серебра, аминооксиуксусная кислота) резко подавляют этот апоптоз. Как бы ни было, этилен, регулируя экспрессию соответствующих генов, контролирует процессы старения и апоптоза у растений. В корнях кукурузы в условиях гипоксии резко усиливается образование этилена, который запускает апоптоз клеток, приводящий к формированию запасающей кислород аэренхимы. Под воздействием этилена увеличивается активность целлюлаз и ксилоглюканэндотрансгликозилаз, которые участвуют в деградации клеточных стенок апоптозных клеток; возрастает также активность протеаз, липаз, ДНК-аз и других гидролитических ферментов. Этилен запускает транскрипцию связанных со старением генов и модулирует (ускоряет) апоптоз. Мутанты растений арабидопсиса с нарушенной восприимчивостью к этилену обладают большей продолжительностью жизни по сравнению с контрольными растениями дикого типа. Абсцизовая кислота (АБК) ингибирует фрагментацию ДНК в клетках алейронового слоя ячменя, а гибберелловая кислота тормозит это действие абсцизовой кислоты; ауксин и цитокинин не влияют на этот процесс. В присутствии АБК протопласты клеток алейронового слоя ячменя выживают, по крайней мере, в течение 20 дней, а в присутствии гиббереллина у большинства протопластов быстро наблюдается выраженная ЗГК, сопровождающаяся деградацией ДНК. Гиббереллин запускает ЗГК в алейроновом слое ячменя. В отличие от апоптоза у животных, в клетках алейронового слоя ячменя образования апоптозных тел не обнаружено, а ДНК гидролизуется до высокомолекулярных фрагментов без выраженной межнуклесомной фрагментации. Таким образом, ЗГК в алейроновом слое ячменя как часть программы развития проростка контролируется гормонально. АБК тормозит апоптоз в клетках алейронового слоя пшеницы и в развивающихся пыльниках ячменя. Для запуска апоптоза в эндосперме зерновок кукурузы существенное значение имеет соотношение АБК и этилена.
Таким образом, можно сделать вывод, что апоптоз является интегральной частью процесса развития растений и представляет собой генетически детерминированную программу смерти клеток. Реализация этой программы в онтогенезе сопровождается специфическими изменениями морфологии клетки, структуры ядра и цитоплазмы, активацией каспаз, нуклеаз, синтеза мтДНК, доменной и межнуклеосомной фрагментацией ядерной ДНК. Этот процесс широко распространен у разных растительных видов и обнаруживается в самых различных тканях растений, он как клеточная дифференцировка (ее терминальная стадия) может контролироваться фитогормонами. Старение органов растений, в основном, идет по пути апоптоза и сопровождается дерепрессией многих специфических (маркерных) генов старения. В целом, по своим проявлениям и механизмам апоптоз у растений довольно сходен с апоптозом у животных. В контроле за апоптозом у растений, как и у животных, принимают участие NO, Са2+ и, по-видимому, керамиды. В одной и той же растительной клетке могут существовать разные пути к запрограммированной гибели. ЗГК в растениях может запускаться многими, в том числе и неблагоприятными факторами (окислительный стресс и другие); существует зависимый от салициловой кислоты апоптоз. ЗГК может быть частью так называемого гиперчувствительного ответа растения при атаке патогенами различной природы (вирусные, бактериальные и грибные инфекции), это обычно сопровождается резким увеличением образования АФК. Ключевая роль в инициации определенных видов апоптоза принадлежит митохондриям: также как и у животных, индуцированный выход из митохондрий цитохрома с и других белковых факторов запускает апоптоз в растительных клетках. Активные формы кислорода могут служитьтриггерными молекулами апоптоза, а антиоксиданты подавляют апоптоз у растений.

Рисунок 115

Приложенные файлы

  • doc 7441144
    Размер файла: 725 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий