Лр 3 ЛИГИРОВАНИЕ ГЕНА ИНТЕРЕСА В ВЕКТОР


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
Лабораторная работа 3

ЛИГИРОВАНИЕ ГЕНА ИНТЕРЕСА В ВЕКТОР

Цель работы:
знакомство с методами создания векторов генной
инженерии


Лигирование ДНК

то ковалентное сшивание цепей ДНК в ду
плексе при
репликации, репарации и рекомбина
ции. Процесс катали
зируют ферменты



лигазы, которые образуют фосфодиэфирные мости
ки между 5’
-
фосфорильной и 3’
-
гидроксильной группами соседних

дезоксинуклеотидов в
местах разрыва ДНК или между двумя молеку
лами ДНК. В генной
инженерии лигирование

пр
иём, с помощью ко
торого чужеродная ДНК
встраивается в вектор.


В качестве источника ДНК для встраивания в вектор могут служить

продукты ПЦР

(полимеразной цепной реакции)
, рестрикции или (реже)
продукты неферментативной

фрагментации ДНК.

В генной инженерии используют ДНК
-
лигазы
E.сoli

и фага Т4. Они

различаются по потребности в кофакторах

NAD+ (в случае лигазы

E.

coli
) и
ATP (фаговая лигаза). ДНК
-
л
игаза фага Т4 катализирует «сши
вание» как
липких, так и тупых концов. ДНК
-
лигаза
E.сoli

не способна

лигировать
тупые концы. Поэтому в экспериментах по клонированию
в подавляющем
большинстве случаев
используют

ДНК
-
лигазу фага Т4
.
Воссоединение
фрагментов возможно в случае существования

5’
-
фосфорильной группы на
конце одного фрагмента и 3’
-
гидроксиль
ной группы на конце другого
фрагмента.
В простейшем случае в
генно
-
инженерных экспериментах
лигиру
ют ген интереса в молекулу
-
вектор. В более сложных случаях
реко
м
бинантные ДНК собирают из множества частей. Такой эксперимент

проводят в несколько этапов.

Для клонирования фрагментов ДНК используют различные векто
ры,
различающиеся по структуре и размерам, но все они должны об
ладать
следующими общими свойствами:




способностью к автономной репликации в реципиентных клет
ках
при наличии встройки чужеродной ДНК;




стабильностью в реципиентных клетках;




стабильным поддержанием чужеродной ДНК;




наличием уникальных сайтов рестрикции, по которым можно

встраивать
чужеродную ДНК и которые расположены в обла
сти,
несущественной для амплификации вектора (удобно, если

эти сайты
находятся в селективных генах);




наличием селективных маркеров, позволяющих идентифици
ровать
клетки, содержащие рекомбинантную ДНК;




отн
осительно небольшим

размером, позволяющим легко от
де
лять
рекомбинантную ДНК от хромосомной ДНК реципиентной

клетки.


Выбор вектора зависит от того, какого размера фрагмент плани
руется
клонировать. Для очень протяжённых фрагментов

более

100 т.

п.

н.
используют так называемые искусственные хромосомы

(ВАС,
bacterial

artificial

chromosomes
),
YAC

(
yeast

artificial

chromosomes
).

Для фрагментов
размером несколько десятков т. п. н. применяют дру
гие векторы. Векторы на
основе фага лябмда пред
назначены для кло
нирования фрагментов размером
20 т. п. н. Векторы, имеющие черты

фага лямбда и плазмид,


космиды
используют для клонирования
фрагментов размером около 40 т. п. н.

Наиболее распространёнными являются плазмидные векторы.
В них можно

заклонировать фрагменты размером несколько т. п.

н.

Большие вставки ДНК
в векторных плазмидах нестабильны, а клони
рование фрагментов ДНК
больше 10 т. п. н. резко снижает эффектив
ность последующей
трансформации.

В настоящее время для облегчения отбора клонов со вставками

используют селективные си
стемы.

Классическим примером такой си
стемы
является бело
-
голубая селекция, реализованная в векторах се
рии pUC,
разработанных в Калифорнийском университете

(см.

Рисунок
1
)



Рисунок
1

-

Схема работы лактозного оперона


В состав векторов входит регуляторная часть lас
-
оперона: ген реп
рессора
laсI и 5’
-
концевая часть структурного гена β
-
галактозидазы

E.coli

lacZ’,
кодирующая так называемый альфа
-
пептид β
-
галак
тозидазы, состо
ящий из
145 аминокислот. Этот пептид

способен in vivo

вза
имодействовать с С
-
концевой частью полипептида без образова
ния пептидной связи и
восстанавливать ферментативную ак
тивность


-
комплементация). В
результате трансформации плазмидой pUC

клеток, имеющих частичную
делецию начальной
части гена lacZ (Δ11


41 аминокислоты), происходит
изменение их фенотипа от Lac− к Lac+.

β
-
галактозидаза обладает
способностью расщеплять субстрат Xgal

(5
-
бром
-
4
-
хлор
-
3
-
индолил
-
бета
-
D
-
галактопиранозид) с образованием

окрашенного в голубой цвет продукта
р
еакции. Поэтому колонии Lac+

клеток, несущих плазмиду pUC, на среде с
Xgal и индуктором lас
-
оперона IPTG (изопропилтиогалактозид),
инактивирующим репрес
сор, окрашены в голубой цвет.

Уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК локали
зованы в
начале гена β
-
галактозидазы в составе полилинкера

(после
довательности
нуклеотидов, содержащей несколько перекрываю
щихся уникальных сайтов
рестрикции). Интеграция чужеродной ДНК

в последовательность
полилинкера нарушает рамку считывания гена

β
-
галактозидазы и
инактивирует фермент, в связи с чем колонии кле
ток, несущие
рекомбинантную плазмиду, на питательной среде с Xgal,

бесцветны
.
Поскольку векторы серии pUC содержат ген устойчиво
сти к ампициллину,
отбор бактерий, несущих рекомбинантные
плаз
миды, можно проводить
одновременно по двум маркерам. На пита
тельной среде с ампициллином и
Xgal вырастают только бактерии,

устойчивые к антибиотику
, т.

е.
содержащие плазмиду pUC, а среди

выросших колоний лишь неокрашенные
будут содержать вставку

чуже
родной

ДНК.

Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК

сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство

эукариотических векторов сконструированы как челночные. Иными

словами,
эти векторы несут два типа сайтов иниц
иации репликации и

два типа
селективных маркерных генов, одни из которых функциони
руют в
Escherichia coli
, a другие


в эукариотических хозяйских клет
ках. Такие
векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей,

насекомых и
клеток млекопитающих.




A
C
G
C
G
T
A
C
G
G
C
A
C
T
G
G
C
A
T
G
T
A
C
T
G
G
G
A
C
C
T
G
C
C
G
C
G
T
G
A
T
C
T
C
G
T
T
A
G
C
T
T




Рисунок 2
-

Плазмида
pBBB


Задача 1

Разработайте

вектор

генной инженерии
на основе плазмиды
pBBB

()

и
"особого гена интеллекта"

(
Таблица
1
)

д
ля создания

трансгенн
ой

Escherichia
coli

способн
ой

вырабатывать белковый препарат под

рабочим

название
м
"Волшебная таблетка от _____________
(
Ф.И.О.

студента
) для увеличения
интеллектуального потенциала студентов группы ПТ
-
1304.


Таблица
1

Вариант

Последовательность нуклеотидов "особого гена интеллекта"

1.


1
gttcgttgca acaaattgat gagcaatgct tttttataat gccaactttg tacacaaaag

2.


61
ttggcaccat ggccgacgac gacgtgctgt tcgaggatgt gtacgagctg tgcgaggtga

3.


121
tcggaaaggg tc
ccttcagt gttgtacgac gatgtatcaa cagagaaact gggcaacaat

Вариант

Последовательность нуклеотидов "особого гена интеллекта"

4.


181
ttgctgtaaa aattgttgat gtagccaagt tcacatcaag tccagggtta agtacagaag

5.


241
atctaaagcg ggaagccagt atctgtcata tgctgaaaca tccacacatt gtagagttat

6.


301
tggagacata tagctcagat ggaatgcttt acatggtttt cgaatttatg gatg
gagcag

7.


361
atctgtgttt tgaaatcgta aagcgagctg acgctggttt tgtgtacagt gaagctgtag

8.


421
ccagccatta tatgagacag atactggaag ctctacgcta ctgccatgat aataacataa

9.


481
ttcacaggga tgtgaagccc cactgtgttc tccttgcctc aaaagaaaac tcggcacctg

10.


541
ttaaacttgg aggctttggg gtagctattc aa
ttagggga gtctggactt gtagctggag

11.


601
gacgtgttgg aacacctcat tttatggcac cagaagtggt caaaagagag ccttacggaa

12.


661
agcctgtaga cgtctggggg tgcggtgtga tcctttttat cctgctcagt ggttgtttgc

13.


721
ctttttacgg aaccaaggaa agattgtttg aaggcattat taaaggaaaa tataagatga

14.


781
atccaaggca gtggagccat atctctgaaa gtgccaaaga cctagtacgt cgcatgctga

15.


841
tgctggatcc agctgaaagg atcactgttt atgaagcact gaatcaccca tggcttaagg

16.


901
agcgggatcg ttacgcctac aagattcatc ttccagaaac agtagagcag ctgaggaaat

17.


961
tcaatgcaag gaggaaacta aa
gggtgcag tactagccgc tgtgtcaagt cacaaattca

18.


1021
actcattcta tggggatccc cctgaagagt taccagattt ctccgaagac cctacctcct

19.


1081
caggacttct agcagcagaa agagcagtct cacaggtgct ggacagcctg gaagagattc

20.


1141
atgcgcttac agactgcagt gaaaaggacc tagattttct acacagtg
tt ttccaggatc

21.


1201
agcatcttca cacactacta gatctgtatg acaaaattaa cacaaagtct tcaccacaaa

22.


1261
tcaggaatcc tccaagcgat gcagtacaga gagccaaaga ggtattggaa gaaatttcat

23.


1321
gttaccctga gaataacgac gcaaaggaac taaagcgtat tttaacacaa cctcatttca

24.


1381
tggccttact tcagactcac gacgtagtgg cacatgaagt ttacagtgat gaagcattga

25.


1441
gggtcacacc tcctcccacc tctccctatt taaacggcga ttctccagaa agtgctaacg

26.


1501
gagacatgga tatggagaat gtgaccagag ttcggctggt acagtttcaa aagaacacag

27.


1561
atgaaccaat gggaatcact ttaaaa
atga atgaactaaa tcattgtatt gttgcaagaa

28.


1621
ttatgcatgg gggcatgatt cacaggcaag gtacacttca tgttggtgat gaaattcgag

29.


1681
aaatcaatgg catcagtgtg gctaaccaaa cagtggaaca actgcaaaaa atgcttaggg

30.


1741
aaatgcgggg gagtattacc ttcaagattg tgccaagtta ccgcactcag t
cttcgtcct


В
Таблица
2

представлены рестриктазы
и
х

сайты
рестрикции
, которые
встречаются в последовательности плазмиды
pBBB
.


Таблица
2

Рестриктазы

Вариант

Название рестриктазы

Сайт рестрикции

1.


AclI

CGTT

2.


HindIII


AGCTT

3.


PciI

CATGT

4.


BspMI


ACCTGC

5.


MluI

CGCGT

6.


MluI
-
HF®

ACGCGT

7.


BceAI

ACGGC

8.


BsrI

ACTGG

9.


BmrI

ACTGGG

10.


BglII

GATCT

Изобр
азите разработанный Вами вектор.

Контрольные вопросы

1.

В каких случаях используют
искусственные

хромосомы
ВАС

и
YAC
?

2.

ДНК какой длины можно заклонировать в простой плазмидный вектор?
Космиду?

3.

Что представляет собой полилинкер?

Оперон?

4.

В какой цвет окрашены к
олонии кишечной палочки несущие
рекомбинантны
е плазмиды на
среде
Xgal

при использование бело
-
голубой селекции
?


5.

Какой признак маркирует устойчивость
к антибиотику ампицил
л
ину

в
случае
использование бело
-
голубой селекции
?

6.

Что представляют собой челночные векторы
?



Приложенные файлы

  • pdf 1107298
    Размер файла: 706 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий