Лр 3 ЛИГИРОВАНИЕ ГЕНА ИНТЕРЕСА В ВЕКТОР


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте файл и откройте на своем компьютере.
Лабораторная работа 3 ЛИГИРОВАНИЕ ГЕНА ИНТЕРЕСА В ВЕКТОР Цель работы: знакомство с методами создания векторов генной инженерии Лигирование ДНК то ковалентное сшивание цепей ДНК в ду плексе при репликации, репарации и рекомбина ции. Процесс катали зируют ферменты − лигазы, которые образуют фосфодиэфирные мости ки между 5’ - фосфорильной и 3’ - гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрыва ДНК или между двумя молеку лами ДНК. В генной инженерии лигирование пр иём, с помощью ко торого чужеродная ДНК встраивается в вектор. В качестве источника ДНК для встраивания в вектор могут служить продукты ПЦР (полимеразной цепной реакции) , рестрикции или (реже) продукты неферментативной фрагментации ДНК. В генной инженерии используют ДНК - лигазы E.сoli и фага Т4. Они различаются по потребности в кофакторах NAD+ (в случае лигазы E. coli ) и ATP (фаговая лигаза). ДНК - л игаза фага Т4 катализирует «сши вание» как липких, так и тупых концов. ДНК - лигаза E.сoli не способна лигировать тупые концы. Поэтому в экспериментах по клонированию в подавляющем большинстве случаев используют ДНК - лигазу фага Т4 . Воссоединение фрагментов возможно в случае существования 5’ - фосфорильной группы на конце одного фрагмента и 3’ - гидроксиль ной группы на конце другого фрагмента. В простейшем случае в генно - инженерных экспериментах лигиру ют ген интереса в молекулу - вектор. В более сложных случаях реко м бинантные ДНК собирают из множества частей. Такой эксперимент проводят в несколько этапов. Для клонирования фрагментов ДНК используют различные векто ры, различающиеся по структуре и размерам, но все они должны об ладать следующими общими свойствами: − способностью к автономной репликации в реципиентных клет ках при наличии встройки чужеродной ДНК; − стабильностью в реципиентных клетках; − стабильным поддержанием чужеродной ДНК; − наличием уникальных сайтов рестрикции, по которым можно встраивать чужеродную ДНК и которые расположены в обла сти, несущественной для амплификации вектора (удобно, если эти сайты находятся в селективных генах); − наличием селективных маркеров, позволяющих идентифици ровать клетки, содержащие рекомбинантную ДНК; − отн осительно небольшим размером, позволяющим легко от де лять рекомбинантную ДНК от хромосомной ДНК реципиентной клетки. Выбор вектора зависит от того, какого размера фрагмент плани руется клонировать. Для очень протяжённых фрагментов более 100 т. п. н. используют так называемые искусственные хромосомы (ВАС, bacterial artificial chromosomes ), YAC ( yeast artificial chromosomes ). Для фрагментов размером несколько десятков т. п. н. применяют дру гие векторы. Векторы на основе фага лябмда пред назначены для кло нирования фрагментов размером 20 т. п. н. Векторы, имеющие черты фага лямбда и плазмид, — космиды используют для клонирования фрагментов размером около 40 т. п. н. Наиболее распространёнными являются плазмидные векторы. В них можно заклонировать фрагменты размером несколько т. п. н. Большие вставки ДНК в векторных плазмидах нестабильны, а клони рование фрагментов ДНК больше 10 т. п. н. резко снижает эффектив ность последующей трансформации. В настоящее время для облегчения отбора клонов со вставками используют селективные си стемы. Классическим примером такой си стемы является бело - голубая селекция, реализованная в векторах се рии pUC, разработанных в Калифорнийском университете (см. Рисунок 1 ) Рисунок 1 - Схема работы лактозного оперона В состав векторов входит регуляторная часть lас - оперона: ген реп рессора laсI и 5’ - концевая часть структурного гена β - галактозидазы E.coli lacZ’, кодирующая так называемый альфа - пептид β - галак тозидазы, состо ящий из 145 аминокислот. Этот пептид способен in vivo вза имодействовать с С - концевой частью полипептида без образова ния пептидной связи и восстанавливать ферментативную ак тивность (α - комплементация). В результате трансформации плазмидой pUC клеток, имеющих частичную делецию начальной части гена lacZ (Δ11 – 41 аминокислоты), происходит изменение их фенотипа от Lac− к Lac+. β - галактозидаза обладает способностью расщеплять субстрат Xgal (5 - бром - 4 - хлор - 3 - индолил - бета - D - галактопиранозид) с образованием окрашенного в голубой цвет продукта р еакции. Поэтому колонии Lac+ клеток, несущих плазмиду pUC, на среде с Xgal и индуктором lас - оперона IPTG (изопропилтиогалактозид), инактивирующим репрес сор, окрашены в голубой цвет. Уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК локали зованы в начале гена β - галактозидазы в составе полилинкера (после довательности нуклеотидов, содержащей несколько перекрываю щихся уникальных сайтов рестрикции). Интеграция чужеродной ДНК в последовательность полилинкера нарушает рамку считывания гена β - галактозидазы и инактивирует фермент, в связи с чем колонии кле ток, несущие рекомбинантную плазмиду, на питательной среде с Xgal, бесцветны . Поскольку векторы серии pUC содержат ген устойчиво сти к ампициллину, отбор бактерий, несущих рекомбинантные плаз миды, можно проводить одновременно по двум маркерам. На пита тельной среде с ампициллином и Xgal вырастают только бактерии, устойчивые к антибиотику , т. е. содержащие плазмиду pUC, а среди выросших колоний лишь неокрашенные будут содержать вставку чуже родной ДНК. Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Иными словами, эти векторы несут два типа сайтов иниц иации репликации и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функциони руют в Escherichia coli , a другие — в эукариотических хозяйских клет ках. Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих. A C G C G T A C G G C A C T G G C A T G T A C T G G G A C C T G C C G C G T G A T C T C G T T A G C T T Рисунок 2 - Плазмида pBBB Задача 1 Разработайте вектор генной инженерии на основе плазмиды pBBB () и "особого гена интеллекта" ( Таблица 1 ) д ля создания трансгенн ой Escherichia coli способн ой вырабатывать белковый препарат под рабочим название м "Волшебная таблетка от _____________ ( Ф.И.О. студента ) для увеличения интеллектуального потенциала студентов группы ПТ - 1304. Таблица 1 Вариант Последовательность нуклеотидов "особого гена интеллекта" 1. 1 gttcgttgca acaaattgat gagcaatgct tttttataat gccaactttg tacacaaaag 2. 61 ttggcaccat ggccgacgac gacgtgctgt tcgaggatgt gtacgagctg tgcgaggtga 3. 121 tcggaaaggg tc ccttcagt gttgtacgac gatgtatcaa cagagaaact gggcaacaat Вариант Последовательность нуклеотидов "особого гена интеллекта" 4. 181 ttgctgtaaa aattgttgat gtagccaagt tcacatcaag tccagggtta agtacagaag 5. 241 atctaaagcg ggaagccagt atctgtcata tgctgaaaca tccacacatt gtagagttat 6. 301 tggagacata tagctcagat ggaatgcttt acatggtttt cgaatttatg gatg gagcag 7. 361 atctgtgttt tgaaatcgta aagcgagctg acgctggttt tgtgtacagt gaagctgtag 8. 421 ccagccatta tatgagacag atactggaag ctctacgcta ctgccatgat aataacataa 9. 481 ttcacaggga tgtgaagccc cactgtgttc tccttgcctc aaaagaaaac tcggcacctg 10. 541 ttaaacttgg aggctttggg gtagctattc aa ttagggga gtctggactt gtagctggag 11. 601 gacgtgttgg aacacctcat tttatggcac cagaagtggt caaaagagag ccttacggaa 12. 661 agcctgtaga cgtctggggg tgcggtgtga tcctttttat cctgctcagt ggttgtttgc 13. 721 ctttttacgg aaccaaggaa agattgtttg aaggcattat taaaggaaaa tataagatga 14. 781 atccaaggca gtggagccat atctctgaaa gtgccaaaga cctagtacgt cgcatgctga 15. 841 tgctggatcc agctgaaagg atcactgttt atgaagcact gaatcaccca tggcttaagg 16. 901 agcgggatcg ttacgcctac aagattcatc ttccagaaac agtagagcag ctgaggaaat 17. 961 tcaatgcaag gaggaaacta aa gggtgcag tactagccgc tgtgtcaagt cacaaattca 18. 1021 actcattcta tggggatccc cctgaagagt taccagattt ctccgaagac cctacctcct 19. 1081 caggacttct agcagcagaa agagcagtct cacaggtgct ggacagcctg gaagagattc 20. 1141 atgcgcttac agactgcagt gaaaaggacc tagattttct acacagtg tt ttccaggatc 21. 1201 agcatcttca cacactacta gatctgtatg acaaaattaa cacaaagtct tcaccacaaa 22. 1261 tcaggaatcc tccaagcgat gcagtacaga gagccaaaga ggtattggaa gaaatttcat 23. 1321 gttaccctga gaataacgac gcaaaggaac taaagcgtat tttaacacaa cctcatttca 24. 1381 tggccttact tcagactcac gacgtagtgg cacatgaagt ttacagtgat gaagcattga 25. 1441 gggtcacacc tcctcccacc tctccctatt taaacggcga ttctccagaa agtgctaacg 26. 1501 gagacatgga tatggagaat gtgaccagag ttcggctggt acagtttcaa aagaacacag 27. 1561 atgaaccaat gggaatcact ttaaaa atga atgaactaaa tcattgtatt gttgcaagaa 28. 1621 ttatgcatgg gggcatgatt cacaggcaag gtacacttca tgttggtgat gaaattcgag 29. 1681 aaatcaatgg catcagtgtg gctaaccaaa cagtggaaca actgcaaaaa atgcttaggg 30. 1741 aaatgcgggg gagtattacc ttcaagattg tgccaagtta ccgcactcag t cttcgtcct В Таблица 2 представлены рестриктазы и х сайты рестрикции , которые встречаются в последовательности плазмиды pBBB . Таблица 2 Рестриктазы Вариант Название рестриктазы Сайт рестрикции 1. AclI CGTT 2. HindIII AGCTT 3. PciI CATGT 4. BspMI ACCTGC 5. MluI CGCGT 6. MluI - HF® ACGCGT 7. BceAI ACGGC 8. BsrI ACTGG 9. BmrI ACTGGG 10. BglII GATCT Изобр азите разработанный Вами вектор. Контрольные вопросы 1. В каких случаях используют искусственные хромосомы ВАС и YAC ? 2. ДНК какой длины можно заклонировать в простой плазмидный вектор? Космиду? 3. Что представляет собой полилинкер? Оперон? 4. В какой цвет окрашены к олонии кишечной палочки несущие рекомбинантны е плазмиды на среде Xgal при использование бело - голубой селекции ? 5. Какой признак маркирует устойчивость к антибиотику ампицил л ину в случае использование бело - голубой селекции ? 6. Что представляют собой челночные векторы ?

Приложенные файлы

  • pdf 1107298
    Размер файла: 706 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий