Белки и аминокислоты


Чтобы посмотреть презентацию с картинками, оформлением и слайдами, скачайте ее файл и откройте в PowerPoint на своем компьютере.
Текстовое содержимое слайдов презентации:

Белки и аминокислоты. Классификация, структура  1. Белки, структура белков, связи.2. Аминокислоты. Классификация аминокислот.3. Разделение, выделение и идентификация белков.4. Анализ аминокислотных последовательностей: определение первичной структуры. . 1. Белки, структура белков, связи. Белки называют также протеинами (греч. «протео» – занимаю 1-е место). Все основные функции организма связаны со специфическими белками. Они присутствуют в каждой клетке и каждом клеточном органоиде. Свойства белков, на которых основана классификация, крайне разнообразны. Так, склеропротеины (кератин и коллаген) нерастворимы и обладают фибриллярной структурой. Микроскопическое изображение нитей кератина внутри клетки Микроскопическое изображение нитей коллагена Глобулярные белки (яичный альбумин и белки сыворотки) растворимы в воде и солевых растворах и имеют сферическую форму. Белки острой фазы воспаления Имеются сложные белки, в молекулу которых входит небелковая часть (простетическая группа). К ним принадлежат нуклеопротеиды, липопротеиды, хромопротеиды (гемоглобин, цитохромы, гемоцианин) и гликопротеиды. Полипептидная цепь, построенная из аминокислот, представляет собой первичную структуру белковой молекулы. Это наиболее важная специфическая структура, определяющая вторичную и третичную структуры. Последовательность расположения аминокислот обуславливает свойства белков. Молекула белка состоит из нескольких сотен аминокислот, поэтому она изогнута определенным образом и образует вторичную структуру. В глобулярных белках полипептидные цепи свернуты определенным образом и образуют компактную, третичную структуру. Структура белка: а – первичная, б – вторичная, в – третичная, г – четвертичная . В структуре белков встречаются различные типы связей. Первичная структура определяется ковалентными (химическими) пептидными связями. Вторичная и третичная структуры стабилизируются следующими видами связей:ионные (электростатические) – между положительными и отрицательными ионами, находящимися на расстоянии 2-3 А,водородные – (длина связи 2,5-3,2 А) более слабые, чем ионные, образуются между 2-мя сильно отрицательными атомами – C, N, O,связи, образующиеся за счет вандерваальсовых сил при взаимодействии полярных боковых цепей,взаимодействие неполярных боковых цепей. Схема пептидной связи. Аминокислоты. Классификация аминокислот. Аминокислота – производное органической кислоты соединение, в котором водород в α-положении замещен на аминогруппу. Т.к. в а.к. присутствуют одновременно кислая и основная группы, они амфотерны.Присутствующие в клетке свободные а.к. образуются в результате расщепления белков или поступают из межклеточной жидкости. Свободные а.к. составляют аминокислотный фонд, из которого клетка черпает строительные блоки для синтеза новых белков. Общая формула аминокислот Схема строения аминокислоты Связь –NH–CO– называется пептидной связью. Комбинация из двух аминокислот – дипептид, из 3-х – трипептид. Пептид, состоящий из небольшого числа аминокислот – олигопептид, из большого – полипептид. Расстояние между двумя пептидными связями равно примерно 3,5 А, а средний объем аминокислотного остатка равен 3,5х4,6х10 А, или 161 А3. Следовательно, например, молекула белка с молекулярным весом 30 000, состоящая из 300 аминокислотных остатков, в полностью вытянутом состоянии должна иметь длину 1000 А, ширину 10 А и толщину 4,6 А. Белки построены из 20 различных а.к., которые можно классифицировать следующим образом: Моноаминомонокарбоновые: глицин (гли), аланин (ала), валин(вал), лейцин (лей), изолейцин (илей).Моноаминодикарбоновые: глутаминовая кислота (глу), аспарагиновая кислота (асп).Диаминомонокарбоновые: аргинин (арг), лизин (лиз), оксилизин (олиз).Гидроксилсодержащие: треонин (тре), серин (сер).Серусодержащие: цистин (цис), метионин (мет).Ароматические: фенилаланин (фен), тирозин (тир).Гетероциклические: триптофан (три), пролин (про), оксипролин (опро), гистидин (гис). 3. Разделение, выделение и идентификация белков. Большинство методов выделения пригодно в основном для гидрофильных белков. В качестве растворителей используются ионные и неионные детергенты, такие как додецилсульфат натрия, холат натрия, соли желчных кислот и др. Процедура очистки белка, как правило, состоит из ряда этапов обогащения. Метод обогащения считают эффективным: если специфическая активность на единицу веса всего белка увеличивается (например, возрастает каталитическая активность фермента на 1 мг белка в пробе).Общая активность после данного этапа обогащения существенно не уменьшается. Для оценки чистоты белкового препарата используют следующие критерии: кристаллизуемость;кинетика растворимости;гомогенность при ультрацентрифугировании или электрофорезе;однозначность данных при определении аминокислотной последовательности;однотипность каталитической активности (отсутствие побочных активностей);гомогенность при изучении хроматографическими методами (при использовании различных систем растворителей). При выделении белка их тканей или клеток необходимо разрушить клеточную структуру, не повредив структуру изучаемого белка. С этой целью используют следующие методы: 1) растирание, 2) фрагментация, 3) воздействие ультразвуком, 4) воздействие химическими и (или) ферментативными агентами.При выделении белков используют буферы, учитывают температуру и ионную силу, а также время очищения белка. Для очистки белка часто используют высаливание (добавление соли), оно, как правило, обратимо. Одним из лучших высаливающих агентов служит (NH4)2SO4, т.к. соль растворима в больших концентрациях. Из органических растворителей для высаливания используют ацетон, уксусную кислоту, диметилсульфоксид и др. Для дальнейшей очистки и обогащения белков используют различия в следующих свойствах: 1) в молекулярной массе, 2) в растворимости, 3) в электрическом заряде, 4) в адсорбируемости определенными веществами, 5) в сродстве к другим молекулам. Существуют 3 основных способа разделения белков на основе их молекулярной массы:1. Разделение в поле тяготения (центрифугирование).2. Метод молекулярного сита. Он основан на том, что поры в мембране или между частицами проницаемы для молекул только в том случае, если d молекул < d пор. 3. Гель-электрофорез с додецилсульфатом натрия (ДСН). ДСН гидрофобной частью связывается с молекулой белка. Молекула ДСН несет отрицательный заряд и, т.о., комплекс белок-ДСН становится сильно электроотрицательным. Собственный заряд белка почти не изменяется. Общий заряд комплекса прямо пропорционален величине белковой молекулы. Подвижность в электрическом поле зависит не только от общего заряда молекулы, а в первую очередь от распределения этого заряда. Обычный электрофорез не позволяет разделять одинаково заряженные частицы. При гель-электрофорезе с ДСН дополнительно используется диффузионный эффект при прохождении через гель. Небольшие молекулы проходят быстрее, чем крупные. Скорость прохождения пропорциональна их величине. Метод гель-электрофореза относительно прост, он является стандартным методом определения молекулярной массы. Однако в результате получаются лишь относительные величины и необходимо использовать подходящие молекулы в качестве стандарта. 4. Анализ аминокислотных последовательностей: определение первичной структуры. Первичная структура белка – это последовательность аминокислот в его пептидной цепи. Аминокислотную последовательность белка впервые определил Сэнгер в 1953 г. Этим белком был инсулин. В настоящее время известны полные или частичные последовательности более чем 700 различных белков. Для определения аминокислотной последовательности белок очищают до гомогенного состояния. В первую очередь определяют, какие из 20 а.к. имеются в этом белке. Для этого белок гидролизуют сильной кислотой до свободных а.к. Гидролизат (смесь аминокислот) разделяют. Для количественного определения применяется ионообменная хроматография. При стандартных условиях с использованием автоматического анализатора аминокислот, а.к. появляются в элюате совершенно определенной последовательности. Здесь также применяют органические растворители (буферные системы). Площадь под кривыми для отдельных аминокислот отражает содержание этих а.к. в смеси (однако коэффициенты экстинкции разных а.к. отличаются друг от друга). Для определения аминокислотного состава молекулу белка расщепляют на фрагменты. При этом важно, чтобы молекула распадалась на определенное число фрагментов определенной длины и чтобы полипептидная цепь разрывалась в определенных местах. Это осуществляют с помощью протеолитических ферментов (трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин и др.)   Наибольшей специфичностью обладает трипсин. Примерно через каждые 5–15 а.к. в белке встречаются остатки аргинина или лизина; поэтому после обработки пептида трипсином образуются фрагменты длиной 5–15 аминокислот. Эти фрагменты отделяют друг от друга хроматографически или электрофоретически. После этого каждый фрагмент анализируют отдельно: сначала устанавливают аминокислотный состав, а затем последовательность а.к. С-концевые а.к. остатки идентифицируются по их отщеплению карбоксипептидазой. А.к. освобождаются последовательно. Около некоторых а.к., например, пролина, карбоксипептидаза связи вообще не расщепляет. N-концевые остатки в пептидах определяют чаще всего «расщеплением по Эдману» (аминопептидаза работает хуже карбоксипептидазы, поэтому ее применяют редко). При этом методе к пептиду добавляют фенилизотиоцианат, что ведет к освобождению соответсвующего производного N-концевой а.к. Это производное относительно легко отделить от остального пептида и идентифицировать. Оставшийся пептид можно вновь подвергнуть той же обработке. При этом, чем длиннее пептид, тем лучше работает метод. Лаурсен модифицировал этот метод, связав пептид с твердым носителем (твердофазный метод), и т.о. распространил применимость этого метода на область коротких пептидов.

Приложенные файлы

  • ppt 846391
    Размер файла: 648 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий