Ферментативное окисление

Новосибирский государственный университет
Кафедра физической химии

















Лабораторная работа К-32

Определение кинетических параметров ферментативного окисления глюкозы кислородом под действием глюкозооксидазы














Выполнили: Никитин С. В.
Федоров А. В.












Новосибирск, 2012
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ


Если термодинамика ставит вопрос о теоретической осуществимости химической реакции, то химическая кинетика занимается исследованием особенностей и закономерностей тех превращений, которые возможно осуществить на практике. Химическая реакция может представлять собой самопроизвольный процесс с точки зрения термодинамики, но протекать с ничтожной скоростью. Как правило, причиной низкой скорости является высокий энергетический барьер, который необходимо преодолеть для запуска превращения. Так, например, алмаз существует в стандартных условиях, хотя термодинамически более стабилен графит. Поэтому для кинетики становится важным понятие скорости превращения вещества. Скорость химической реакции определяют как число актов превращения в единице объёма в единицу времени [1].
На скорость химической реакции можно воздействовать. Катализатор – вещество, которое, будучи добавлено в реакционную массу, сокращает время, необходимое для достижения равновесного состояния. Для уменьшения скорости реакции используют ингибиторы.
Следует отметить, что в физиологических условиях (pH
·6,5-7,0, T
·40°С) большинство реакций протекают с ничтожной скоростью. В организме их скорость должна быть намного выше. Для их осуществления необходимы ферменты. Ферменты представляют собой уникальные природные катализаторы. Главная их особенность – высокая специфичность по отношению к субстрату и высокая эффективность. Следовые концентрации ферментов способны ускорять реакции в сотни тысяч раз (вплоть до 108-1012) [2]. Такой результат объясняется взаимодействием фермента с субстратом с образованием фермент-субстратного комплекса, что приводит к значительному понижению энергии активации, а значит, к ускорению химической реакции.
Скорость ферментативной реакции зависит от многих параметров. Во-первых, от концентрации фермента и его активности (способности ускорять реакцию), во-вторых, от концентрации субстрата. Кроме того, значительное влияние оказывают состав буферной среды и pH. Например, для функционирования многих ферментов необходим кофермент (кофактор) в виде катиона некоторого металла (Mg2+, Ca2+ и др.). С ростом температуры скорость ферментативной реакции увеличивается, но при этом растёт и скорость дезактивации. Значит, существует температурный оптимум для ферментативной реакции.

Кинетика ферментативных реакций.

Первыми исследователями стали Леонор Михаэлис и Мод Ментен в 1913 году [3]. Они предложили способ определения скорости ферментативной реакции, введя следующие допущения:
Реакция образования фермент-субстратного комплекса обратима.
13 EMBED Equation.3 1415
Фермент в активном состоянии связывает только 1 молекулу субстрата.
Фермент-субстратный комплекс необратимо превращается в продукт реакции
Лимитирующей является стадия образования продукта (k2<Квазистационарные условия 13 EMBED Equation.3 1415
Принято считать, что 13 EMBED Equation.3 1415

Тогда легко получить выражение для скорости ферментативной реакции:
13 EMBED Equation.3 1415
13 EMBED Equation.3 1415
Константы скоростей можно выделить в виде одного постоянного множителя.
13 EMBED Equation.3 1415

Величина KM получила название константы Михаэлиса. Константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции составляет половину максимальной. Пусть аналитическая концентрация фермента равна 13 EMBED Equation.3 1415. Фермент присутствует в свободном и связанном состояниях:
13 EMBED Equation.3 1415
На практике используют разные способы определения константы Михаэлиса.
Координаты Лайнуивера-Берка. График отображает зависимость 13 EMBED Equation.3 1415 от величины 13 EMBED Equation.3 1415 и представляет собой прямую. Пересечение графика с осью ординат даёт 13 EMBED Equation.3 1415, а пересечение с осью абсцисс – значение 13 EMBED Equation.3 1415. При малых значениях концентрации субстрата этот способ даёт большую погрешность, поэтому на практике данный метод используют для приблизительных оценок. Уравнение, таким образом, имеет следующий вид: 13 EMBED Equation.3 1415.
Метод Иди (Эди) – Хофсти. Проводят построение графика 13 EMBED Equation.3 1415.
Метод Эйзеншталя – Корниш – Боудена. Предполагает собой построение графика 13 EMBED Equation.3 1415. Для каждой концентрации субстрата отмечают точки с координатами (-[S], 0) и (0, V0). По этим двум точкам строят графики, которые представляют собой прямые. Точка пересечения графиков для разных концентраций субстрата имеет координаты (КМ,Vmax). Этот способ определения константы Михаэлиса считается наиболее точным. Уравнение может быть записано так: 13 EMBED Equation.3 1415.
Общим недостатком данной теории является её ограниченная применимость. Всё вышесказанное справедливо только для начальных скоростей реакций. Кроме того, существуют аллостерические ферменты. Кинетика химических реакций с их участием отличается от кинетики ферментативных реакций Михаэлиса-Ментен.


Свойства глюкозы

Глюкоза с точки зрения химика представляет соединение, в котором присутствуют свойства альдегида и многоатомного спирта, и относится к классу углеводов. Природным сахаром является D-глюкоза. Её L-аналог получен синтетически. Отличие между ними заключается во вращении плоскости поляризованного света в разные стороны (D – вправо, L - влево).
В растворе реализуется сложное равновесие между разными конформациями молекулы. Открытой формы в смеси, как правило, очень немного, значительно преобладают две циклические –
· и
·. В зависимости от растворителя из раствора кристаллизуется либо
· (H2O, CH3OH; угол вращения +112°), либо
· (C5H5N, CH3COOH; угол вращения +19°) формы [4].
13 EMBED ChemDraw.Document.6.0 1415
Глюкоза легко окисляется по первому атому углерода (показано стрелкой).

Ферментативное окисление глюкозы кислородом под действием глюкозооксидазы.

В данной работе перед нами стояла задача определить максимальную скорость и константу Михаэлиса для реакции ферментативного окисления глюкозы. Побочным продуктом реакции окисления
·-D-глюкозы является пероксид водорода.
13 EMBED ChemDraw.Document.6.0 1415
Для измерений нами была использована методика, описанная в [5]. Скорость реакции может быть рассчитана, если известно изменение концентрации реагента или продукта за некоторое время. Определение концентрации растворённого вещества можно осуществить спектрофотометрическим методом, если вещество поглощает в данной области спектра и его сигнал можно идентифицировать среди прочих.
В нашей работе определение концентрации проводилось косвенным путём за счёт реакции продукта окисления глюкозы H2O2 с иодидом калия. При этом по умолчанию считалось, что вторая реакция протекает намного быстрее, чем анализируемая, и отсутствуют побочные реакции восстановления пероксида водорода.
Смешение реагентов проходило непосредственно в кювете прибора. В качестве фона использовали буферный раствор с pH=6.00, приготовленный из однозамещённого фосфорнокислого калия KH2PO4.
Методика эксперимента состояла в том, что выделяющийся в реакции окисления глюкозы пероксид водорода вводили в реакцию с раствором иодида калия: 13 EMBED Equation.3 1415 Образующийся анион 13 EMBED Equation.3 1415 имеет интенсивный максимум поглощения при 350 нм, который регистрируется спектрофотометром. На приборе установили длину волны 2860см-1, что соответствует частоте
·8,58*1014 Гц, или длине волны 350нм.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Растворы реагентов.
Раствор KH2PO4 был приготовлен растворением навески 1.71г в 200мл воды. Значение pH раствора отрегулировали посредством pH-метра, добавляя по каплям водный раствор NaOH. Приготовленный раствор количественно перенесли в мерную колбу на 250,0 мл, довели до метки водой и использовали в качестве буферного в эксперименте.
Раствор иодида калия приготовлен растворением навески 0,85г в 8мл буфера. К полученному раствору добавили 2 мл 9% раствора молибдата натрия Na2MoO4. Был получен раствор иодида калия с концентрацией 0,4997моль/л.
Раствор
·-D-глюкозы был приготовлен навески 1,05г в 10мл буфера. Концентрация раствора 0,5556 моль/л.
Эксперимент.
В кварцевую кювету спектрофотометра длиной 1см вносили заданные количества реагентов, потом добавляли раствор глюкозооксидазы (10мкл), перемешивали и записывали график интенсивности поглощения от времени.
Каждый опыт повторяли не менее двух раз для получения правильных результатов и уменьшения случайной ошибки. После этого изменяли концентрацию
·-D-глюкозы (субстрата) в пробе и вновь проводили измерения.
Прибором регистрировалась увеличение оптической плотности во времени, что говорило об увеличении концентрации 13 EMBED Equation.3 1415 в анализируемом растворе. Изменение концентрации поглощающего вещества можно рассчитать согласно закону Бугера-Ламберта-Бэра из изменения оптической плотности раствора. 13 EMBED Equation.3 1415. Величина коэффициента экстинкции 13 EMBED Equation.3 1415 на данной длине волны была нам известна (2,5·104 л/(моль·см)). Из величины временной развёртки (4,4мин) было определено время каждого опыта, что позволило рассчитать скорость превращения. Среднюю скорость определяли как среднее арифметическое результатов каждого опыта. В таблице приведена скорость ферментативной реакции в расчёте на 1мкл фермента.
Результаты занесли в таблицу.
Таблица 1
Номер опыта
Объём пробы, мкл
Концентрация субстрата, [S], моль/л
Время, мин
Изм опт плотн
Изм конц, мкмоль/мл
Скорость, мкмоль/(мл·мин)
Средняя скорость, мкмоль/(мл·мин)

1
10
0,0028
0,96
0,12
0,0048
0,00050
0,00053

1


0,86
0,12
0,0048
0,00056


2
20
0,0055
0,61
0,12
0,0048
0,00079
0,00079

2


0,61
0,12
0,0048
0,00079


3
50
0,0138
0,56
0,22
0,0088
0,00157
0,00168

3


0,45
0,20
0,0080
0,00179


4
100
0,0276
0,38
0,26
0,0104
0,00271
0,00280

4


0,40
0,29
0,0116
0,00290


5
200
0,0553
0,34
0,32
0,0128
0,00381
0,00380

5


0,40
0,38
0,0152
0,00380


6
400
0,1106
0,35
0,42
0,0168
0,00477
0,00483

6


0,35
0,43
0,0172
0,00489


График 1 иллюстрирует, что скорость ферментативной возрастает при росте концентрации субстрата. Постепенно скорость роста падает (см. Приложение) и кривая выходит на плато, асимптотически приближаясь к уровню максимальной скорости реакции.


График Лайнуивера-Берка

Таблица 2
Обратная концентрация
363,57
181,79
72,35
36,18
18,09
9,04

Обратная скорость
1894,74
1266,67
595,74
356,61
262,83
207,06


13 EMBED Excel.Chart.8 \s 1415
Определена константа Михаэлиса 0,02±0,01моль/л и максимальная скорость 0,0050±0,0025мкмоль/(мл·мин).

График Эйзеншталя-Корниш-Боудена

Определение константы Михаэлиса графическим методом Эйзеншталя-Корниш-Боудена (см. Приложение, график 3). Способ получения графика описан в теоретической части. Из графика видно, что идеального совпадения с теорией нет, так как наблюдается “плавающая точка” пересечения графиков. Такое явление довольно обычно для подобных экспериментов.
Причина, наверное, состоит в погрешностях приборов. Из графика 3 видно, что уменьшение концентрации субстрата приводит к увеличению точности нанесения точек по оси ординат в ущерб точности нанесения точек по оси абсцисс. Мы не можем брать очень близкие между собой концентрации субстрата, так как иначе из экспериментального графика (см. Приложение) в силу случайных или систематических ошибок невозможно с хорошей точностью рассчитать начальную скорость.







Таблица 3
Концентрация субстрата, моль/л
0,0028
0,0055
0,0138
0,0276
0,0553
0,1106
0,2764

Скорость реакции, мкмоль/(мл*мин)
0,00053
0,00079
0,00168
0,00280
0,00380
0,00483
0,00502

Обратная скорость, мл*мин/мкмоль
1887
1266
595
357
263
207
199


Из графика 3 находим, что константа Михаэлиса находится в пределах 0,0015±0,005моль/л, что совпадает с результатом, полученным методом двойных обратных координат Лайнуивера-Берка. Максимальная скорость реакции определена как 0,0056±0,0003 мкмоль/(мл·мин).
График Иди-Хофсти

Таблица 4
Скорость реакции, мкмоль/(л*мин)
0,5278
0,7895
1,6786
2,8042
3,8048
4,8295
5,0188

Скорость / Концентрация субстрата *10-6,мин-1
192
144
121
101
69
44
18

13 EMBED Excel.Chart.8 \s 1415
Построенный по экспериментальным данным график был приближен прямой по методу наименьших квадратов. Было получено уравнение прямой в координатах (W, W/[S]), что позволило определить константу Михаэлиса как –tg угла наклона прямой графика с положительным направлением оси абсцисс. Фактически константа Михаэлиса – коэффициент пропорциональности в уравнении прямой. Получено среднее значение 0,030±0,007 моль/л.

.13 EMBED Excel.Chart.8 \s 1415








13PAGE 15


13PAGE 14315



1


·


·

глюкозооксидаза

-H2O2

O2 воздуха


График 2

График 4




Приложенные файлы

  • doc 6361039
    Размер файла: 634 kB Загрузок: 1

Добавить комментарий