Боровиков экзамен


Современные методы в биотехнологии
РК 1
1. Цели и задачи клеточной инженерии. Объекты изучения клеточной инженерии
Клеточная инженерия - это отрасль науки, задачей которой является создание новых клеток и получение тканей, органов и организмов из клеточного материала на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции.
Цель, которую несёт в себе клеточная инженерия: получение лекарств, выведение качественных сортов культурных растений, создание новых пород животных, и как высшая точка — избавление нашей цивилизации от всех болезней
Задачи клеточной инженерии:
1)Получение и применение культур клеток животных, человека, растений и бактерий для культивирования вирусов с целью создания вакцин, сывороток, диагностических препаратов.
2)Культивирование культур клеток для получения биологически активных веществ.
3)Получение моноклональных антител (гибридом) для использования в медицине и ветеринарии.
4)Генно-инженерные манипуляции с клетками для получения новых форм, новых культур клеток, биопрепаратов и др.
Основным объектом и средством исследования в клеточной инженерии является клеточная культура, которая служит для получения каллуса, суспензии клеток или простопластов.
2. Микроклональное размножение растений
Микроклональное размножение — один из способов вегетативного размножения в условиях «invitro». Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный. Оба способа имеют преимущества и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести генетическую пестроту получаемого посадочного материала и длительность ювенильного периода. При вегетативном - сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.
Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клональногомикроразмножения (получение в условиях invitro, неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму. Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ перед традиционными способами размножения:
- получение генетически однородного посадочного материала;
- освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;
- высокий коэффициент размножения (105—106 — для травянистых, цветочных растений, 104—105 — для кустарниковых древесных, 104 — для хвойных); - сокращение продолжительности селекционного процесса;
-ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
- размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
- возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;
Первые достижения в области клональногомикроразмножения были получены в конце 50-х годов XX столетия французом Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей. Исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы, салата и изучали влияние состава питательной среды на процессы регенерации и формирования растений
3. Этапы микроклонального размножения
Процесс клональногомикр. можно разделить на четыре этапа:
- выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры;
- собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества мериклонов;
- укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+ 2°, + 10 °C);
- выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.
Основное преимущество клональногомикроразмножения — это получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала. Этого возможно достичь, используя меристемные ткани апексов и пазушных почек органов стеблевого происхождения. Меристема состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков (примордиев) и является свободной от инфекции.
Существует несколько методов клональногомикроразмножения растений. Многие ученые проводя индивидуальные исследования по влиянию условий (питательная среда, концентрация минеральных и органических веществ, тип субстрата) культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания что в свою очередь привело к созданию новых классификаций методов клональногомикроразмножения
Исходя из предложенных в литературе методов микроразмножения растений, этот процесс возможно осуществлять следующими путями:
1.Активация развития уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки и интеркамерные зоны стебля);
2. Индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта;
3. Индукция соматического эмбриогенеза;
4. Дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной тканях.
4.Каллусная ткань основной объект исследований при клеточной инженерии. Практическое применения каллусной ткани.
В биотехнологии каллусом называют недифференцированные клетки, являющиеся тотипотентными и способными поэтому дать начало целому растению. Являются объектом клеточной инженерии. В биологии растений каллусом называют также клетки, образующиеся на раневой поверхности растения в виде опробковевающей ткани, которая возникает в результате деления пограничных с раной клеток.
Каллусная ткань способствует зарастанию ран, срастанию прививок и т. д.
Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают:
- рыхлые, сильно оводненные, легко распадающиеся на отдельные клетки;- средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;
- плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов. Как правило, в длительной культуре на средах, содержащих ауксины, каллусные ткани теряют пигментацию и становятся рыхлыми.
Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал, который наиболее часто используют для клеточной селекции. Как правило, работу проводят на первичной или переса­дочной каллусной ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на протяжении ряда субкультивирований. Однако при работе с каллусными культурами многие исследователи отмечают существенные недостатки данного объекта: медленный рост ткани, неравноценное для всех клеток действие токси­ческих веществ, которые применяются в качестве селективного фактора, а также потеря регенерационной способности в процессе культивирования каллусных клеток. Несомненно, проводить селекцию целесообразно на уровне одиночных клеток (суспензионная культура, протопласты). Однако для многих видов растений не разработаны эффективные технологии и способы культивирования одиночных клеток. Поэтому, несмотря на пе­речисленные выше недостатки использования каллусных культур, этот способ селекции остается для некоторых видов растений пока единственным.
Практическое применения каллусной ткани.Оказывается, ткани и клетки лекарственных растений в изолированной культуре продолжают синтезировать важные для медицины вещества. Ткань женьшеня, например, содержит такие же вещества, поднимающие силы утомленного человека, как и сам знаменитый «корень жизни». В недалеком будущем на заводах, которые выпускают лекарственные препараты, появятся специальные цехи, где синтез лекарственных препаратов будет доверен тканям растений.
А какие широкие возможности открываются для генетиков и селекционеров, выводящих новые сорта растений! Изолированные ткани и клетки легко обрабатывать химическими веществами или излучениями, вызывающими мутации — изменения в наследственном аппарате клетки. Из таких тканей и клеток образуются растения с новыми, иногда очень ценными свойствами.
Совсем недавно исследователи, используя специальные ферменты, научились освобождать растительные клетки из прочной целлюлозной оболочки, которая их окружает. «Голые» протопласты (клетки без оболочки) можно заставить слиться, восстановить оболочку, начать делиться, образовать ткань, а затем и целое растение. Изучаются возможности «скрещивать» таким способом клетки очень далеких между собой видов растений. И уже можно мечтать о соединении в одном растении полезных свойств пшеницы и устойчивых и неприхотливых диких злаков или же помидоров и картофеля.
Культура тканей помогает селекционерам преодолевать также трудности, возникающие при скрещивании отдаленных форм растений. Из цветка растения одной из скрещиваемых форм выделяют семяпочку, помещают ее на питательную среду и здесь оплодотворяют пыльцой растений другой формы. Из оплодотворенной семяпочки в пробирке выращивается росток, который затем можно пересадить в грунт.
И наконец, культуру изолированных тканей можно использовать для «оздоровления» сортов культурных растений. Многие из них поражены вирусными заболеваниями, которые грозят уничтожить тот или иной ценный сорт. Из ростка такого растения можно выделить группу здоровых клеток и вырастить из них растение, не пораженное вирусом, а затем размножить его отводками, черенками или клубнями.
5. Методика и этапы получения безвирусного картофеля
Одним из важнейших способов борьбы с вирусными болезнями картофеля является получение здорового семенного материала и ускоренное его размножение на основе метода культуры тканей. Культура меристемных тканей предусматривает изоляцию апикальных (верхушечных) меристем, которые находятся в верхушечной части вегетативных органов и свободны от вирусной инфекции. С помощью этого метода были получены растения картофеля, свободные от ХВК, АВК, УВК, и других. 
Термотерапия - воздействие на растения, ростки и клубни высокими температурами (+37 - +42 °С) с целью инактивации возбудителя или увеличения «безвирусной зоны» в верхушечных или боковых почках. Действие повышенных температур широко применяется как вспомогательный прием, позволяющий увеличить вероятность выделения безвирусных эксплантов из вегетирующих растений с последующим культивированием их на питательной среде. Вьщерживание клубней картофеля, заражённых РЬКУ, при +38 - +40 ""С в течение 20 - 25 дней резко снижает долю растений с признаками болезни. Выращивание растений картофеля при +35 - +37 °С и постоянном свете в течение 60- 120 дней не только увеличивает безвирусные зоны в меристематических тканях, но позволяет выделить пазушные почки величиной 2-3 мм, свободные от вирусов X и S. Температурная обработка увеличивает процент безвирусных эксплантов меристемы в общем числе выделенных. Применяют также метод термообработки ростков, высаженных на питательную среду после поверхностной стерилизации. Ростки (около 1 см) после поверхностной стерилизации высаживают на питательную среду и помещают в термокамеру при 38 °С с освещением около 5000 лк в течение 18 часов в сутки. Через 4 недели из развившихся в этих условиях растений выделяют верхушечную меристему или верхушечную почку.
В настоящее время для оздоровления картофеля от вирусов метод культуры тканей широко используют в сочетании с химиотерапией, которая предусматривает использование в технологии оздоровления веществ, обладающих антивирусными свойствами. Известно большое количество веществ микробного, растительного и животного происхождения, содержащихся, в частности, в культуральных жидкостях некоторых видов дрожжей и плесневых грибов, в соке высших растений, в молоке, способных задерживать репродукцию вирусов в растениях, снижать их концентрацию в клеточном соке, задерживать и ослаблять признаки вирусных болезней.
Полученный с помощью метода меристемного клонирования высококачественный исходный материал ускоренно размножается в стерильной культуре и в сооружениях защищенного грунта. Наиболее широко используется метод микрочеренкования in vitro (в пробирках), позволяющий исключить возможность повторного заражения растений и получить наиболее высокую интенсивность размножения. Применяется также черенкование растений на почвозаменяющих субстратах, отделение отводков, ростков клубней, укоренение верхушек и пазушных побегов, выращивание клубней на гидропонных установках.
6. Слияние соматических клеток. Гибридомная техника. История развития и предшествующие научные открытия
В 1975 г. выходит статья Милстейна и Келера о получении гибридных клеток, секретирующих единственный тип антител, способных расти в культуре (на питательных средах). А в 1984 году за открытие «гибридомной технологии» они были удостоены Нобелевской премии в области биологии.
В 1970-х годах молодой немецкий иммунолог Георг Кёлер изучал генетическую изменчивость антител. Для исследования надо было изолировать клон антителообразующих клеток (АОК) - плазматических клеток (производных от В-лимфоцитов). Необходимо отметить, что В-лимфоциты могут жить только в организме хозяина, и в искусственной питательной среде они быстро гибнут. Их длительное культивирование вне организма невозможно. Наоборот, клетки опухоли из плазматических клеток, называющиеся плазмоцитомами или миеломами, хорошо культивируются и размножаются in vitro и их называют “бессмертными». Для реализации проекта Кёлер поехал в Англию, в лабораторию Цезаря Мильштейна, изучавшего клоны плазмоцитом, и они вместе разработали оригинальный подход к этой проблеме: решили получить гибрид нормальной АОК и опухолевой клетки. В случае успеха такой гибрид унаследовал бы от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой - бессмертие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту. Это им удалось осуществить, создав гибридомную технологию.
Предпосылки метода:
Получение миеломных клеток (опухолей из антителообразующей клетки / предшественника).
Адаптация миелом к условиям культивирования вне организма (in vitro)
Метод соматической гибридизации клеток
Гибридизация соматических клеток
Сущность этого способа заключается в том, что в качестве родительских используются не половые клетки (гаметы), а клетки тела (сомы) растений, из которых изолируют протопласты. И в отличие от полового скрещивания, где имеет место одностороннее исключение протоплазмы, при соматической гибридизации в образовавшемся гибриде оба партнера имеют более или менее равный цитоплазматический статус. Слияние протопластов способствует объединению двух различных цитоплазм. В большинстве исследований слияние протопластов высших растений приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридное растение содержит цитоплазму обоих партнеров, ядро — одного.
7. Гибридомы, штаммы – продуценты моноклональных антител
Гибридомы (гибридные опухолевые клетки) образуются в результате слияния лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, с клетками миеломы костного мозга, культивируемыми in vitro.
В системе in vitro слияние соматических клеток может быть индуцировано вирусами, например вирусом Сендай, электрическим воздействием - электрослиянием или химическим веществом - полиэтиленгликолем (ПЭГ).
Не знаю что сюда еще можно написать…В остальных ответах будет польностью расписана гибридомная технология, можете сюда дополнить
8. Основные этапы получения моноклональных антител
Этапы получения моноклональных антител:
Иммунизация животных антигеном
Отбор и тестирование сыворотки крови
Извлечение селезенки и подготовка В-лимфоцитов к слиянию
Подготовка миеломных клеток к слиянию
Слияние
Культивирование гибридных клеток на селективных питательных средах
Клонирование гибридомных клеток
Отбор нужных клонов (тестирование)
Массовая наработка гибридомных клеток
Получение культуральной жидкости или асцита, содержащих моноклональные антитела
Выделение и очистка моноклональных антител
9. Принципы, условия и механизм гибридизации В-лимфоцитов и миеломных клеток.
Подсчитывают количество миеломных клеток и спленоцитов и сливают клетки с помощью ПЭГ. Существуют два основных варианта добавления ПЭГ, используемых в настоящее время. Первый метод заключается в следующем: в течение 1 мин добавляют 1 мл 50% раствора ПЭГ при 37°С с постоянным перемешиванием, затем раствор постепенно разбавляют до 10 мл в течение нескольких минут средой без сыворотки, после чего клетки центрифугируют и русуспендируют в среде культивирования. Во втором методе используют более длительную обработку клеток раствором ПЭГ. К осадку клеток добавляется 30-35% ПЭГ при комнатной температуре. Клетки центрифугируют 2 минуты, затем их оставляют при комнатной температуре еще 5-7 минут. Затем их разводят в большом объеме среды с сывороткой, разливают в лунки планшета и культивируют в условиях СО2-инкубатора.
10. Моноклональные антитела и их применение в биологии и биотехнологии и других отраслях народного хозяйства
Моноклональные  антитела - это иммуноглобулины, синтезируемые одним клоном клеток. Антитела синтезируются в организме как проявление защитной реакции при попадании в него чужеродного вещества (антигена). Моноклональное антитело связывается только с одной антигенной детерминантой на молекуле антигена
В 1975 г. выходит статья Милстейна и Келера о получении гибридных клеток, секретирующих единственный тип антител, способных расти в культуре (на питательных средах). А в 1984 году за открытие «гибридомной технологии» они были удостоены Нобелевской премии в области биологии. Предпосылки метода:1) Получение миеломных клеток (опухолей из антителообразующей клетки / предшественника). 2)Адаптация миелом к условиям культивирования вне организма (invitro). 3)Метод соматической гибридизации клеток.Моноклональные антитела (монАТ), в отличие от поликлональных, являются продуктом секреции одной антитело- продуцирующей клетки, либо ее потомков (клона), образовавшихся в процессе деления этой клетки. Все монАТ, являющиеся продуктом одного клона, представлены идентичными молекулами, отсюда вытекают основные свойства моноклональных антител:
Все молекулы монАТ, являющиеся продуктом одного клона, имеют одинаковую специфичность, то есть, направлены против одинаковых мест связывания (антигенных детерминант) на каком-либо конкретном антигене, тогда как поликлональная сыворотка имеет в своем составе антитела к разным участкам связывания с антигенам и даже к разным антигенам.
Все молекулы монАТ, являющиеся продуктом одного клона, имеют одинаковое сродство к связываемому антигену (аффинность), то есть моноклональные антитела бывают высокоаффинными («прочно» связывающие антиген) и низкоаффинные (образующие легко диссоциирующий комплекс с антигеном). Поликлональная сыворотка всегда представлена антителами разной аффинности.
Применение моноклональных антител. В Медицине, в биотехнологии, в сельскохозяйственной отрасли, в ветеринарии, в области продовольственной безопасности, в области охраны природы и экологии
В медицине:диагностика: Создание диагностических тестов (ИФА, ИХА, ДНК-зонды и др.)если к антителам присоединить радиоактивные или магнитоактивные материалы и ввести их в организм, то можно выявить патологические зоны.
Биотехнология. Очистка веществ:антитела присоединяют к твердой матрице, добавляют смесь молекул, содержащих искомый антиген, образовавшиеся комплексы антиген-антитело отмывают, от примесей, не связанных с матрицей, после разрушения связей с антителом остается нужный антиген.Антиидиотипические антитела — это антитела, вырабатываемые в ответ на введенные антитела определенного типа, псевдоантиген; их выработка стимулирует иммунную систему, на этом принципе основано получение стандартных антигенов для диагностических тестов и вакцин нового типа.
Зонды для точного определения природы молекул поверхности клеток и клеточных органелл, детекции активности ферментов.
В с/х – диагностика вирусных болезней растений.
Продовольственная безопасность – обнаружение в продуктах питания опасных для здоровья веществ.
Экология – обнаружение предельно допустимых концентраций вредных веществ.
Иммуномагнитный фильтр: привязанные к ферромагнитным частицам моноклональные антитела, находясь в магнитном поле, могут высоко специфично извлекать клетки, например из опухоли или из костного мозга; затем иммуномагнитный сорбент отделяют и остаются только извлеченные клетки; так можно связывать и удалять клетки и получать из костного мозга здоровые клетки для кроветворения.
«Мишенная» лекарственная терапия:

11. Опишите схему получения моноклональных и поликлональных антител и назовите их принципиальные отличия.
Этапы получения моноклональных антител:
Иммунизация животных антигеном
Отбор и тестирование сыворотки крови
Извлечение селезенки и подготовка В-лимфоцитов к слиянию
Подготовка миеломных клеток к слиянию
Слияние
Культивирование гибридных клеток на селективных питательных средах
Клонирование гибридомных клеток
Отбор нужных клонов (тестирование)
Массовая наработка гибридомных клеток
Получение культуральной жидкости или асцита, содержащих моноклональные антитела
Выделение и очистка моноклональных антител

12. Наработка моноклональных антител методом invitro и invivo
Наработка моноклональных антител.После отбора гибридомных клеток, синтезирующих интересующие исследователя антитела, приступаем к их наработке с целью получения больших количеств МКА.
Invitro. В культуральной жидкости на планшете или в матраце: содержание антител при этом составляет от 10 до 100 мкг в 1 мл.
В начале культивирования на планшетах гибридомы растут медленно из-за низкой плотности посева. В связи с этим при пересеве их разводят не более чем в 3-5 раз. Ускорению роста клеток способствует добавление клеток питающего слоя (перитонеальные макрофаги). Клетки поддерживают в логарифмической фазе роста и избегают повышения концентрации выше 0,5 млн/мл. Клетки можно культивировать в стационарной культуре, в роллерной, или культиваторах (ферментерах). Для получения максимальной продукции моноклональных антител клеткам позволяют расти до предельной плотности. В такой культуре через определенное время наблюдается гибель гибридных клеток. Надосадочная жидкость собирается, а клеточный осадок отбрасывается, то есть не пытаются культивировать дальше оставшиеся живые клетки.
Invivo. Для получения больших количеств антител вводят гибридные живые клетки в организм животных (мышей линии balb/c) и получают от них асцитную жидкость. Предварительно животным вводят агенты, повышающие способность гибридом расти в брюшной полости. В качестве такого агента чаще всего выступает пристан – 0,5 мл за 10-14 суток до введения клеток. В асцитной жидкости концентрация антител значительно выше (1-8мг в 1 мл.).
13. Методы выделения и очистки иммуноглобулинов ( антител)
Для многих целей не требуется очистка антител, и они используются в виде культуральных жидкостей или асцитных жидкостей. Грубую иммуноглобулиновую фракцию можно получить высаливанием белков с последующим диализом.
Чтобы выделить чистые антитела, сначала определяют их класс и подкласс, т. к. способы очистки отличаются. Для этого используют метод иммунодиффузии по Ухтерлони.
Для выделения чистых антител лучше всего подходит метод очистки на иммуносорбентах.
Если не удается выделить антитела прямым способом, то пользуются методами аффинной и ионообменной хроматографии.
14. Методы длительного хранения штаммов гибридных клеток. Крио консервация. Лиофилизация. Преимущества и недостатки.
Основные задачи хранения культур
: поддержание их жизнеспособности, сохранение стабильности таксономически важных признаков, а также любых других определенных свойств, представляющих интерес для науки и практики.
В коллекциях жизнеспособность микроорганизмов поддерживается преимущественно следующими методами
: 1) периодическими пересевами (субкультивирование); 2) под минеральным маслом; 3) высушиванием; 4) лиофилизацией; 5) в условиях низких и ультранизких температур.
Субкультивирование
- традиционный метод хранения культур (чаще всего аспорогенных) и заключается он в пересевах культур на свежие питательные среды один-два раза в месяц. Между пересевами микроорганизмы хранят в темноте при температурах 5 - 20°С. При использовании этого метода хранения культур должны быть соблюдены три условия
: 1) подходящая поддерживающая среда; 2) идеальная температура хранения; 3) необходимая частота пересевов.
Преимуществом методаявляется простота и удобный визуальный контроль за чистотой культуры или ее морфологической изменчивостью, а к недостаткам
следует отнести возможность заражения, краткосрочность хранения, трудоемкость работы и большой расход реактивов.
Хранение под минеральным маслом
заключается в следующем: культуру микроорганизмов выращивают на благоприятной агаризованной питательной среде и заливают стерильным вазелиновым маслом. Слой масла (0,5 - 1,0 см) замедляет скорость обменных процессов микроорганизмов и предохраняет поверхность среды от высыхания. Покрытые маслом культуры хранят в холодильнике. Большинство сапрофитных бактерий сохраняют жизнеспособность в течение 8 - 14 лет, дрожжи и мицелиальные грибы пересевают через 2 - 3 года.
Хранение под маслом имеет следующие преимущества
: относительно длительное сохранение стабильности свойств микроорганизмов, сокращение затрат на пересевы, возможность использования в любой микробиологической лаборатории. Недостаток метода
- слабая разработанность протоколов для многих групп бактерий.
Высушивание
- простейший метод хранения микроорганизмов, в процессе которого происходит обезвоживание микробных клеток. В высушенных (до остаточной влажности 10 - 12%) клетках биохимические реакции приостанавливаются или протекают очень медленно. Процесс высушивания лучше всего переносят спорообразующие виды. Широко применяют воздушное высушивание микроорганизмов на различных адсорбентах: в стерильной почве, песке, глине, фильтровальной бумаге, стеклянных бусах, крахмале и т.д. Адсорбенты защищают микроорганизмы от сильного высыхания, связывают свободную воду и поддерживают определенный уровень влажности. Разновидностью метода является L-высушивание: микроорганизмы в суспензионной среде высушивают под вакуумом в стеклянных ампулах, погруженных в водяную баню с контролируемой температурой.
Преимущества метода
Высушенные культуры микроорганизмов легко хранить и транспортировать, они широко используются для хранения хлебопекарных и кормовых дрожжей, бактериальных удобрений (нитрагин, азотобактерин), энтомопатогенных препаратов.
Лиофилизация
заключается в удалении воды из замороженных суспензий под вакуумом, т.е. при этом вода испаряется, минуя жидкую фазу. Выживаемость лиофилизированных клеток зависит от специфических особенностей вида и штамма, стадии роста и концентрации клеток, состава защитных сред, режима лиофилизации, условий реактивации. После лиофилизации для выведения клеток из состояния анабиоза создают условия, снижающие осмотический шок и стресс, возникающий при вскрытии ампул. Лучше всего восстановление свойств происходит на богатых натуральных средах.
Преимущества метода
. Этот метод считается одним из самых экономичных и эффективных методов длительного хранения микроорганизмов. При его использовании многие разнородные группы бактерий и бактериофагов сохраняются в жизнеспособном состоянии 30 и более лет. Недостаток метода
- сложная и недостаточно разработанная технология способа хранения, требуется специальное оборудование.
Хранение микроорганизмов при низких и ультранизких температурах
используется в тех случаях, когда культуры не выдерживают лиофилизации (некоторые автотрофные бактерии, спирохеты, микоплазмы, водные фикомицеты, различные вирусы). Микроорганизмы замораживают либо в рефрижераторах (от - 12°С до - 80°С) либо используют рефрижераторы с азотом: газово-фазовый (- 150°С) или жидко-фазовый (- 196°С). Считается, что грамположительные бактерии более устойчивы к замораживанию, чем грамотрицательные. Чтобы оживить замороженные культуры, их быстро оттаивают при 37°СМетодика криоконсервации, способы замедления роста
При получении клеточных линий с полезными признаками встает проблема сохранения этих признаков. Растения могут хранить генетическую информацию в семенах, однако этот источник не вполне надежен, так как со временем из-за мутаций всхожесть семян падает. Кроме того, некоторые растения размножаются только вегетативно. Этим обусловлена необходимость сохранения части материала in vitro. С другой стороны, в некоторых случаях удается получить новые клеточные линии, синтезирующие большее количество вторичных метаболитов, то есть более продуктивные, которые тоже нуждаются в сохранении.
Для исследования физиологических и биохимических процессов, протекающих в тканях, также требуются стандартные исходные культуры, чем вызвана необходимость сохранять материал в течение определенного промежутка времени, когда идут серийные эксперименты. Все это делает проблему сохранения генофонда весьма актуальной.
Можно, конечно, пассировать и перевивать клеточные культуры. Однако при этом возникает опасность сомаклональной изменчивости, накопления мутаций, контаминаций (заражения чужеродным генетическим материалом). Это также требует определенных финансовых и трудовых затрат (необходимость частых пересадок, расходы, связанные со средой и т.д.). Цель исследователей состоит в увеличении интервала между пересадками. Существует разные подходы к сохранению культур:
- криосохранение,
- замедление роста,
- сушка (распылительная и лиофильная) – для клеток микроорганизмов.
Криосохранение
Криосохранение - замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре -196oC.
Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов:
- вид и тип клеток,
- их концентрация в суспензии,
- состав среды для консервирования,
- вид и концентрация криопротектора,
- режим охлаждения и отогрева,
- способ реабилитации клеток после отогрева.
Существенную роль в успешном замораживании клеток играет их морфофизиологическое состояние: клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной консервации, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Клетки для замораживания отбирают в середине экспоненциальной фазы ростовой кривой.
Немаловажное значение имеет и плотность замораживаемой суспензии. Оптимальные результаты по восстановлению клеток были получены при замораживании клеточной суспензии плотностью 1*105 - 5*106клеток в 1 мл.
Для растительных клеток часто требуется предварительное культивирование в особых условиях. В среду добавляют различные вещества, например:
2-6% маннит или сорбит для уменьшения размера вакуолей;
аминокислоты, в первую очередь пролин, который служит для связывания воды в клетке (концентрация до 1 моля или 11,5%), аспарагин, γ-аминомасляную кислоту;
диметилсульфоксид (ДМСО), который добавляют к среде для предкультивирования в концентрации от 2,5 до 10% на 48 часов для увеличения проницаемости цитоплазматической мембраны;
кроме того, применяют искусственное закаливание к холоду, когда снижают температуру культивирования, имитируя естественный осенний процесс подготовки к периоду зимнего покоя (применим только для растений умеренного климата). Клеточные культуры выдерживают несколько суток при температуре +8 - +10oC, а затем при +2 - +5oC в течение 1 - 6 недель.
Процесс замораживания растительных клеток от животных отличает, в основном, наличие этапа предварительного культивирования.
Криопротекторы - вещества, позволяющие снизить повреждающее действие физико-химических факторов при криоконсервировании. К ним относятся сахароза, декстран, этиленгликоль, поливинилпирролидон, диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин. Для определения токсичности криопротектора клетки выдерживают при комнатной температуре в различных его концентрациях в течение 30 - 50 минут, после чего определяют их жизнеспособность. Дополнительно оценивают его протективные свойства путем пробного замораживания и оттаивания культур. Наиболее часто в качестве криопротекторов используют глицерин и ДМСО. Перед добавлением криопротектора суспензию клеток концентрируют путем центрифугирования, надосадочную жидкость сливают. Криопротекторы вносят в культуру за час до замораживания, что приводит к изменению проницаемости мембраны, изменению точки замерзания и оттаивания.
Программы охлаждения могут быть различными, но для всех них характерна медленная скорость охлаждения. При замораживании происходит образование льда внутри и снаружи клеток. Характер этих изменений зависит от изучаемого образца и обработки криопротекторами, но главным образом, от скорости охлаждения. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. В этом случае клетки повреждаются. Обычно охлаждение проводят в два этапа.
1-й этап: от +20 до -28oC со скоростью 1 градус в минуту (для растительных клеток скорость замораживания 0,5 градуса в минуту до -35оС), выдерживают при этой температуре 15 минут.2-ой этап: погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до - 196oC).
Замораживание производят в специальных аппаратах. При их отсутствии - на спиртовой бане (0,5 - 1 литр спирта наливают в термос с металлической колбой, погружают в него ампулы на 15 минут и добавляют при помешивании жидкий азот или сухой лед; доводят температуру до -32oC  (температура должна быть не выше -28 и не ниже -32оС). Далее переносят ампулы в жидкий азот.
При размораживании ампулы пинцетом переносят в водяную баню с температурой +37 - +40оС, ампула объемом в 1 мл размораживается в течение 0,5 - 1 минуты.
После размораживания клетки отмывают либо в ростовой среде (животные), либо в поддерживающей среде. Растительные клетки также можно отмывать 3 - 10% раствором сахарозы.
Далее клетки проверяют на жизнеспособность с помощью витальных красителей, окрашивающих мертвые клетки. Окончательным критерием служит четкое возобновление роста на стандартных питательных средах, используемых для данной культуры.
Перевиваемые культуры животных клеток после размораживания имеют повышенную чувствительность к вирусам, которая проявляется в течение первых двух пассажей. Далее чувствительность возвращается к исходной.
Замедление роста
Замедления роста можно добиться следующими методами:
1. Хранение под слоем минерального масла (для бактериальных и грибных культур).
2. Изменение газового состава и атмосферного давления внутри культурального сосуда.
3. Изменение светового режима.
4. Охлаждение до температуры прекращения активного роста.
5. Применение гормональных и осмотических ингибиторов. Из гормональных ингибиторов наиболее часто используют хлорхолинхлорид (для растительных клеток), из осмотических - маннит в концентрации 3-6%.6. Замена СaCl2 на Ca(NO3)2 в питательных средах.
Для картофеля в качестве способа, позволяющего сохранить генофонд, рекомендуется клубнеобразование в пробирках.
15. Методы иммуноанализа, основанные на использовании моноклональных и поликлональных антител
В иммуноферментном анализе используются поли- и моноклональные антитела как по отдельности, так и вместе. Относительная легкость получения поликлональных антител из антисывороток иммунизированных животных в ряде случаев дает возможность пренебречь их гетерогенностью. Однако разработка метода получения моноклональных антител — продуктов гибридных клеток — дала им огромные преимущества в иммунохимическом анализе в связи с уникальными свойствами, выгодно отличающими их от антисывороток. Использование моноклональных антител в иммуноферментном анализе дает возможность работать с практически неограниченным источником антител, однородных по молекулярным и иммунологическим свойствам. С их появлением открылись новые возможности для структурного изучения антигенов. Это связано с тем, что моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, связываются со специфическим участком на поверхности белковой молекулы — антигенной детерминантой и могут быть использованы в качестве селективных зондов на определенные структурные участки.     А — сэндвич >-анализ с поликлональными антителами стадия 1 — инкубация антигена с иммобилизованными антителами с последующей отмывкой несвязавшихся компонентов стадия II — добавление меченных ферментом антител, инкубация и отмывка несвязавшихся компонентов стадия III — детекция ферментативной активности Б — сэндвич>-ана-лиз с моноклональными антителами стадия 1 — инкубация антигена с моноклональными иммобилизованными антителами и конъюгатом антител с ферментом с последующей отмывкой всех несвязавшихся компонентов, III — детекция ферментативной активности
По-видимому, предела чувствительности метода электропереноса с последующим ИФА достигнуть еще не удалось. Весьма вероятно, что доступную на сегодняшний день чувствительность в ближайшем будущем удастся заметно повысить за счет улучшения качества конъюгатов и использования более чувствительных субстратов. Применение нашей методики позволяет в системе [БСА — антитела против БСА] регистрировать антитела при их концентрации в растворе 10 нг/мл, а антиген-—в количестве 10 нг на 0,5-сантиметровую полоску. При этом мы используем кроличьи поликлональные антитела. Применение моноклональных антител для обнаружения антигенов патогенных паразитов позволяет повысить чувствительность обнаружения до 50 пкг. Полагают, что предел чувствительности обнаружения антигенов на блоте с помощью ИФА может достигать 10—20 пкг. Не исключено, что применение более чувствительной системы фермент—субстрат позволит выйти за рамки названных ограничений чувствительности метода. [c.351]    В сыворотке иммунизированных животных всегда накапливаются продукты, секретируемые многими клонами В-лимфоцитов. Сывороточные антитела при любых схемах иммунизации представляют собой смесь молекул антител, гетерогенных по специфичности, аффинности и классовой принадлежности, вследствие чего имеется неизбежная перекрестная реактивность иммунных сывороток с разными антигенами. Перекрестная реактивность делает трудным или невозможным идентификацию уникальных антигенов. Моноклональные антитела, в отличие от поликлональных, являются продуктами потомков всего лишь одной В-клетки, и поэтому препараты моноклональных антител имеют особые свойства, вытекающие из небывалой степени биохимической гомогенности моноклональные антитела высокоспецифичны. Они направлены против одной и той же антигенной детерминантымоноклональные антитела стабильны как эталоны в отношении специфичности и аффинности (прочности связи с антигеном). Исследователь может целенаправленно подобрать моноклон, вырабатывающий антитела только нужного сорта , т. е. класса, подкласса, специфичности, аффинитета. [c.309]    Реагенты этой товарной позиции представлены либо на подложке, либо в форме препаратов и содержат более одной составляющей. Например, они могут содержать примеси из двух или более реагентов или единичных реагентов, растворенных в растворах, кроме воды. Они могут также быть представлены в форме бумаги, пластиков или других материалов (используемых в качестве подложки или основы), пропитанных или покрытых одним или более диагностических или лабораторных реагентов, таких как лакмусовая, pH или pole-finding бумага (бумага для определения полярности) или предварительно покрытые иммуно-контрольные пластинки. Реагенты этой товарной позиции могут также быть упакованы в виде наборов, состоящих из нескольких компонентов, даже если один или более компонентов являются отдельными химически определенными соединениями группы 28 или группы 29, синтетическим красящимвеществом товарной позиции 3204 или любым другим веществом, которое будучи представленным отдельно классифицируется в другой товарной позиции. Примерами таких наборов являются такие, которые используютсядля контроля глюкозы в крови, кетонов в моче и т.п., или такие, которые основаны на ферментах. Однако диагностические наборы, имеющие основные свойства продуктов товарной позиции 3002 или 3006 (например, основанные на моноклональных или поликлональных антителах), исключаются из этой товарной позиции. [c.391]    Особенностью таких клеток является их способность размножаться и продуцировать антитела в искусственных условиях вне организма. С помощью специальных методой клонирования можно выделить одну гибридную клетку, которая, размножаясь, будет секретировать в неограниченных количествах антитела только одного вида — моноклональные антитела. Подчеркнем, что моноклональные антителагомогенны как по специфичности, так и по физи-ко- HYPERLINK "http://chem21.info/info/17513" химическим свойствам. Вопросы, связанные с получением поликлональных и моноклональных антител для иммунохимического анализа, подробно рассмотрены в гл. 5, 6. [c.12]    Метод может быть использован для вычисления констант связывания как поликлональных, так и моноклональных антител. [c.163]    Используя специфические связывающие свойства антител, исследователь может выбирать между двумя различными формамиреагента, приготовленного на их основе это обычные поликлональные антисыворотки (или иммуноглобулиновые фракции, полученные из сыворотки) и моноклональные антитела (МКА). Препараты и тех, и других получают различными путями с различной целью выбор между ними осуществляется зачастую не произвольно, а в большой степени зависит от соответствия специфических свойств антител требованиям теста. [c.21]    Специфичность моноклональных антител. Основным свойством, на котором основано применение моноклональных антител в иммуноанализе, является высокая специфичность взаимодействия. Поликлональные антисыворотки часто имеют высокую перекрестную реактивность, что делает затруднительным и даже невозможным [c.170]    Использование моноклональных антител, направленных к двум различным антигенным детерминантам на антигене ( сэндвич -мо-дификация иммуноанализа), позволяет сократить время анализа. При употреблений поликлональных антисывороток иммуноанализ [c.171]    В этой ситуации очень большое значение имеют хорошие теоретические и методические руководства. Настоящая книга (которая выходит в двух томах) относится к категории именно таких руководств. Она написана коллективом сотрудников отдела иммунологии медицинского колледжа Университета г, Бирмингем при участии сотрудников отдела клеточной иммунологии Оксфордского университета (Англия), Особенно ценным представляется то обстоятельство, что в книге обобщен собственный экспериментальный опыт авторов, и поэтому она представляет собой последовательное изложение основных методов получения поликлональных и моноклональных антител, характеристики антигенов и качественной и количественной оценки реакций антиген — антитело. [c.5]    Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимыеагрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибриднойтехнологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]    Свойства поликлональных антисывороток и моноклональных антител [c.21]    Основной принцип ELISA — специфическое связывание первого антитела с мишенью. Если молекула-мишень представляет собой белок, то его очищенный препарат обычно используют для получения антител, при помощи которых затем и выявляют данную мишень. Антитела, которые образуются в сыворотке (антисыворотке) крови иммунизированного животного (обычно кролика), связываются с разными антигеннымидетерминантами (эпитопами) моле-кулы-мишени. Такую смесь антител называют поликлональным препаратом. Использование поликлональных антител имеет два недостатка, существенных для некоторых методовдиагностики 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить две сходные мишени, т. е. когда патогенная (мишень) и непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной детерминантой. Однако эти проблемы вполне разрешимы, поскольку сейчас научились получать препараты антител, выработанных к одной антигенной детерминанте, т. е. препараты моноклональных антител. [c.184]    В медицине моноклональные антитела применяют прежде всего для диагностики различных заболеваний. Такие бактериальные заболевания, как кокковые, паразитарные инфекции, малярия, а также грибки хламидии, при помощи мкАТ диагносцируются гораздо точнее, чем другими, традиционными методами. В вирусологии использование мкАТ дало возможность разработать условия антигенного анализа вирусов гораздо более информативного, чем при использовании поликлональных антител. Этот метод позволил получить уникальную информацию об антигенных детерминантах ДНК- и РНК-содержащих вирусов и их изменчивости. В частности, были идентифицированы антигенные детерминанты вирусов гриппа, полиомиелита, гепатита А и др. [c.495]    Поликлональные или моноклональные, либо их комбинация в качестве первых и вторых антител [c.28]    При ТОЛЬКО что описанной процедуре исходные антитела (анти-Х) продуцируются всей иммунной системой кролика. Следовательно, эти антитела поликлональны, ибо их вырабатывают лимфоциты, обладающие разной степенью специфичности по отношению к X. Моноклональные антитела, вырабатываемые-клетками-потомками одного лимфоцита, можно получить соответствующим скринингом, отобрав лимфоциты желательной специфичности. Получение моноклональных антител обещает сильно увеличить специфичность иммуноцитохимических методов идентификации нейроактивных веществ в нейронах. Кроме того, этот общий метод можно приспособить для еще более тонких измерений, таких как визуализация специфической РНК, в которой закодирован синтез определенного пептида или белка (см. гл. 4). [c.221]    Как и следует ожидать от системы, работающей по принципу клональной селекции, даже одиночная антигенная детерминанта будет, как правило, активировать много различных клонов с поверхностными рецепторами, обладающими разным сродством к данной детерминанте. Напрнмер, даже сравнительно простая структура ДНФ-группы обеспечивает возможность многих различных взаимодействий, н, когда эта группа связана с белком-носителем, она обычно стимулирует выработку сотен различных видов антител к ДНФ, каждый нз которых является продетом отдельного клона В-клеток. Такой ответ называют поликлональным. Когда реагируют лишь несколько клонов, ответ называют олигоклональным, а когда весь ответ сводится к реакции лишь одного клона В- нли Т-клеток, его называют моноклональным. Ответы на большинство антигенов поликлональны. [c.14]    Эффективность аффинной хроматофафии зависит преимущественно от выбора лиганда или акцептора, который определяет природу вьщеляемого мембранного белка. Существенным фактором в этом случае является сродство лиганда к рецептору, и поэтому самыми эффективными лигандами оказываются специфические блокаторы или антагонисты нейрорецепторных белков. Иногда для вьщеления конкретного белка используют две или три ступени аффинной хроматофафии на разных сорбентах и с разньаш лигандами. Получили широкое распространениеметоды иммуноаффинной хроматографии, в которых в качестве лигандаиспользуется поликлональные или моноклональные антитела, полученные к компонентам рецептора. [c.268]    Клоны с иммобилизованными антителами к -галактозидазе можно приготовить, как это описано в разд. 5.4, или использовать коммерческие препараты. Возможность повторного использования колонки зависит от свойств антител (моноклональных или поликлональных) и жесткости элюирующих растворов. Колонки с поликлональными антителами(полученные, как здесь описано) могут быть использованы более 20 раз без значительного уменьшения их связывающей способности. Колонка, содержащая 5 мг аффинноочищенных поликлональных антител к -галактозидазе, обычно связывает по меньшей мере 1 мг гибридного белка. [c.157]    Наиболее простой способ снятия неспецифического фоновогоизлучения состоит в использовании твердофазных вариантов метода. В качестве твердой фазы берут пблистирольные пробирки, микропланшеты, полиакриламидные шарики. Иммобилизация антител (моноклональных или поликлональных) на полистироле осуществляется методом нековалентной физической адсорбции, а в случае полиакриламидных частиц — ковалентным связыванием. Различие в способах иммобилизации обусловливает некоторые различия в свойствах иммобилизованных антител. Из. всех перечисленных носителей полиакриламидные шарики, как правило, обеспечивают. повышенную стабильность и иммунореактивность иммобилизованных антител, более быструюкинетику специфического взаимодействия, что улучшает точность анализаи его воспроизводимость. [c.142]    Получение моноклональных антител к полипептидному продукту генетически охарактеризованной открытой рамки считывания (ОРС) открывает широкие возможности для иммунохи-мического и функционального анализа такого продукта. Этот метод сложнее, чем описанный в предыдущей главе метод получения поликлональных антителк продукту ОРС, и должен рассматриваться скорее как дополнительный, а не альтернативный подход. Общая схема получения и использования моноклональных антител приведена на рис. 6.1. Мы настоятельно рекомендуем каждому исследователю получать и поликлональные, и моноклональные антитела. Основные преимущества моноклональных антител, а именно возможность получения их в неограниченном масштабе и высокая специфичность, очень существенны в том случае, когда возникает необходимость в углубленном исследовании продукта ОРС, а не просто в его выявлении. Наличие моноклональных антител облегчает количественный анализ продукта ОРС и часто дает возможность быстро получать его в биологически активной форме. Специфичность моноклональных антител также может быть использована для тонкого картирования их участков связывания (эпитопы) па молекуле полипептида— продукта ОРС эта информация дополняется данными о способности антител усиливать или подавлять биологическую активность продукта ОРС. [c.171]    Моноклональные антитела могут эффективно использоваться в иммунопреципитации и в иммуноцитохимических методах. На ранних этапах наших исследований при использовании и того, и другого метода мы сталкивались с трудностями из-за повышенного фонового сигнала, который отсутствовал при использовании поликлональных антител. Нам удалось преодолеть эти затруднения в табл. 6.7 и 6.9 приводятся соответствующиеметодики, которые, как мы обнаружили, во многих случаях хорошо работают. [c.196]    Иммунологические методы пгароко используются для идентификации мембранных компонентов, их локализации, оценки количества, выделения. Это методы получения поликлональных и моноклональных антител к компонентам мембран, иммуно-блоттинг (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата на рия с перенесением разделенных белков на нитроцеллюлозные фильтры для последуюп] его выявления с по- [c.202]    В очень редких случаях может наблюдаться перекрестная реактивностьмоноклональных антител по отношению к неродственным антигенам. Это связано со сходным пространственным распределением зарядов, полярности и гидрофобности на отдельных участках таких молекул. Подобная ситуация реализуется, например, при взаимодействии эндорфинов и алкалоидов с одними и теми же клеточными рецепторами. Однако по отношению к моноклональным антителам перекрестная реактивность подобного рода наблюдается крайне редко. Размеры структур, распознаваемых моноклональными антителами, меньше, и распознаются они точнее, чем структуры, распознаваемые смесью поликлональных антител. Учитывая то, что антигенсвязывающий центр антител имеет полицентровую структуру, необходимо помнить, что направленность моноклональных антител к одному эпитопу и высокая специфичность не исключает возможности их перекрестной реактивности с эпитопами схожей химической структуры, хотя при этом обычно наблюдается различие констант связывания. [c.170]    Поликлональная антисыворотка может содержать до 10 ООО различных типов молекул IgG. Напротив, все молекулы моноклональных антител должны быть идентичными. Моноклональные антителапредпочтительнее в методах конкурентного иммуноанализа, поскольку в этом случае можно утверждать, что меченый или связанный с твердой фазой антиген и определяемое вещество конкурируют за один и тот же центр связывания. Моноклональные антитела очень хорошо работают в сандвич -анализе, поскольку, как правило, хорошо известна специфичность их эпитопов. Такие антитела легко получать в больших количествах и с высокой степенью чистоты. Большинство нативных антител бивалентны, и все они моноспецифичны. Недавно с помощью гибридных гибридсяк и методов генной инженерии получены новые типы антител. Антитела MOiyT быть мечены или связанными с твердой фазой с помощью пассивной адсорбции или за счет ковалентных связей. [c.10]    Поликлональные антитела, применявшиеся ранее в тестах на беременность, неизменно давали перекрестные реакции с LH, имеющимся в моче любой женщины, поэтому с помо1Цью этих тестов можно было надежно определять только высокие концентрации h G. Кроме того, аффинность специфичность поликлональных аятисывороток и содержание специфических антител в них изменялись от партии к партии в широких пределах. Развитие гибридомной технологии получения моноклональных антител [6 ] позволило решить проблемы, связанные со специфичностью и непостоянством свойств антисывороток. На базе моноклональных антителпоявилась возможность создания высокочувствительных тестов с использованием не только кон урентных, но и прямых сандвич -методов. [c.94]16. Иммуноферментный анализ
Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных низкомолекулярных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала. Теоретические основы ИФА опираются на современную иммунохимию и химическую энзимологию, знание физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на основные принципы аналитической химии.
ИФА является одним из наиболее активно развивающихся направлений химической энзимологии. Это обусловлено тем, что в ИФА уникальная специфичность иммунохимической реакции (то есть антитела связываются исключительно с определёнными антигенами, и ни с какими другими) сочетается с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки (вплоть до 10−21 моль в образце). Высокая стабильность реагентов, простота методов регистрации, возможность создания каскадных систем усиления различных химических сигналов, относительно низкая цена и многие другие достоинства метода ИФА способствовали его широкому внедрению в различные области медицины, сельское хозяйство, микробиологическую и пищевую промышленность, охрану окружающей среды, а также в научные исследования
Взаимодействие антигена с субпопуляцией антител
Ранее для количественного описания эффективности взаимодействия антиген-антитело за основу была взята простая модель взаимодействия одновалентного антигена и одновалентного антитела. Но так как молекула антитела имеет несколько антигенсвязывающих центров и, кроме того, способна взаимодействовать с несколькими антигенными детерминантами одной молекулы антигена, то такая характеристика образования иммунохимического комплекса является весьма упрощённой. Для описания более близкого к реальности процесса взаимодействия поливалентного антитела с поливалентным антигеном введён термин авидность, или функциональная аффинность (функциональное сродство). С биологической точки зрения именно функциональная аффинность играет основную роль в иммунном ответе на инфицирование организма вирусами или бактериями, имеющими на своей поверхности повторяющиеся антигенные детерминанты.
Процесс образования комплекса антиген-антитело состава 1:1, в котором реализуются поливалентные взаимодействия, также является обратимым и может быть охарактеризован константой комплексообразования. С энергетической точки зрения образование поливалентного комплекса намного выгоднее, чем моновалентного. Например, эффективная константа комплексообразования IgG может в 1000 и более раз превышать константу одиночных связей
Ферменты, используемые в ИФА в качестве меток
Принципиальная возможность применения ферментов в качестве меток в ИФА обусловлена чрезвычайно высокой чувствительностью регистрации ферментов в растворе. Если обычными спектрофотометрическими или флуориметрическими методами можно зарегистрировать образование продукта в концентрации 10−7 моль/л, то концентрация фермента составит при этом 10−13 моль/л. Причём принципиально возможным является значительное уменьшение пределов обнаружения ферментов как за счёт увеличения времени ферментативной реакции, так и увеличения чувствительности регистрации образовавшегося продукта. В этой связи перспективными являются люминесцентные методы детекции ферментативных реакций, а также методы, основанные на ферментативном усилении детекции продуктов первичной ферментативной реакции («каскады»).
К выбору ферментных меток в ИФА предъявляется ряд общих требований. Основными являются следующие:
высокая специфичность и удельная каталитическая активность, позволяющая обнаружить метку в низких концентрациях;
доступность фермента, возможность получения достаточно чистых ферментных препаратов, сохраняющих высокую активность после химической модификации при получении конъюгата с антигенами или антителами;
стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом;
простота и чувствительность метода определения концентрации фермента.
Наибольшее распространение в гетерогенном ИФА (где используются реагенты, иммобилизированные на поверхности твёрдых носителей) получили пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и β-D-галактозидаза. Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций.Наиболее доступной является пероксидаза хрена. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислению перекисью окрашенные соединения.
Каталитическую активность глюкозооксидазы регистрируют с теми же хромогенами, что и активность пероксидазы, однако чувствительность её определения по сравнению с пероксидазой несколько ниже. Основным достоинством фермента служит полное отсутствие его в плазме крови, что даёт возможность использования этого фермента в гомогенных методах ИФА (реагенты для всех стадий ИФА находятся в водном растворе).
Щелочная фосфатаза и её конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако имеет относительно высокую стоимость. Разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы НАДФ. Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт НАД определяется в ферментативной системе регенерации кофактора.
β-D-Галактозидаза является также широко используемым ферментом как в гомогенном, так и в гетерогенном ИФА. Она катализирует гидролиз лактозы с образованием глюкозы и галактозы. Если вместо природного субстрата взять 4-метилумбеллиферил-β -D-галактозид, при гидролизе образуются галактоза и 4-метилумбеллиферон, регистрируемый флуориметрически.
Во всех коммерческих тест-системах используется пероксидаза хрена, выбор которой определяется её высокой удельной каталитической активностью, доступностью, стабильностью, простотой детекции. В качестве субстратного реагента наиболее часто применяется орто-фенилендиамин (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ) с перекисью водорода, продукт окисления которых регистрируется фотометрически. Для остановки ферментативной реакции применяют «стоп реагент», который добавляют во все исследуемые и контрольные пробы в равных количествах. Наиболее часто в качестве «стоп реагента» применяют серную кислоту. Учёт результатов проводят спектрофотометрически при длине волны 450—490 нм.
Материалы и оборудование: Раствор антигена подобранной концентрации; положительная контрольная сыворотка крови животных; отрицательная контрольная сыворотка крови животных; исследуемые сыворотки крови животных; конъюгат - антивидовые антитела, меченные пероксидазой хрена; 1%БСА; 0,1 М фосфатный буферный раствор, рН 7,4 (ФБ); 0,05 М карбонат-бикарбонатный буферный раствор, рН 9,6 (КББ); 0,15 М цитратный буферный раствор, рН 5,0 (ЦБ); Твин-20; ОФД; 30% раствор Н2О2; раствор для остановки ферментативной реакции 2М Н2SО4; автоматические пипетки с регулируемым объемом (5 - 1000 мкл) и наконечники к ним; многоканальная автоматическая пипетка с регулируемым объемом (50 - 200 мкл) и наконечники к ней; стеклянная или пластиковая лабораторная посуда (бутыли для буферов, флаконы, мерные цилиндры, химические стаканы, колбы, пробирки, эппендорфы, ванночка для многоканальной пипетки); штатив для пробирок или эппендорфов; весы; магнитная мешалка; рН-метр или полоски индикаторной бумаги; 96-луночные планшеты с плоским дном; спектрофотометр (Expert-96); холодильник; термостат.
Ход  работы:
1 Все лунки планшета, за исключением первого столбца (1А - 1Н), сенсибилизируют антигеном. В лунки первого столбца планшета вносят по 100 мкл ФБ-Т.
После удаления из лунок несвязавшихся компонентов и трехкратной промывки планшета свободные участки твердой фазы блокируют 1%-м БСА в ФБ-Т, внося в каждую лунку по 100 - 200 мкл раствора. Инкубируют 1 ч при 37°С.
Во время инкубации блокирующего раствора готовят последовательные разведения контрольных и исследуемых сывороток от 1: 100 до 1: 12800 на ФБ-Т. Все пробирки с сыворотками должны быть четко подписаны.
После удаления блокирующего раствора и трехкратного отмывания лунок вносят по 100 мкл растворов сывороток: «положительную» сыворотку - в лунки второго столбца (2А-2Н); «отрицательную» сыворотку - в лунки третьего столбца (3А-3Н); исследуемых сывороток – в лунки 4—12 рядов (А-Н). Инкубируют 1 ч при 37°С, после чего лунки трижды промывают ФБ-Т.
Во все лунки, кроме 1Е - 1Н, вносят по 100 мкл конъюгата в рабочем разведении в ФБ-Т. Лунки 1Е - 1Н заполняют промывочным буфером. Инкубируют 1 ч при 37°С, затем планшет трижды промывают.
Во все лунки вносят по 100 мкл субстратной смеси, накрывают планшет фольгой или черной бумагой и следят за развитием цветной реакции. В зависимости от скорости ферментативной реакции, которую контролируют визуально, инкубация длится 10 - 30 мин при комнатной температуре.
Останавливают реакцию добавлением в каждую лунку 50 мкл раствора 2М Н2SО4. С помощью спектрофотометра измеряют оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 492 нм.
Оценка результатов. По результатам измерения оптической плотности (ОП) на спектрофотометре вычисляют средние арифметические ОП положительного (2А-2Н), отрицательного (3А-3Н) контролей и сравнивают их с ОП исследуемых сывороток. В зависимости от используемых в ИФА реагентов и на основании предварительных опытов положительными (т. е. содержащими специфические антитела) считают сыворотки, оптическая плотность которых, например, равна или превышает среднее арифметическое положительного контроля, или превышает среднее арифметическое отрицательного контроля на 2-3 стандартных (средних квадратичных) отклонения.
17. Дот-вариант ИФА
Твердофазный ИФА - вариант теста, когда один из компонентов иммунной -реакции (антиген или антитело ) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем промывания. I. При определении антител в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом  и субстрат/хромоген для фермента. II. При определении антигена в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента.
Гетерогенный или твердофазный ИФА (ТИФА). Наибольшее распространение в биологии, медицине и ветеринарии получили различные варианты гетерогенного ИФА. Эту группу методов называют также: ИФА с разделением компонентов; твердофазным ИФА (ТИФА); фермент зависимым иммуносорбентным анализом (От англ.enzyme-linkedimmunosorbentassay – ELISA). Анализ проводят в несколько этапов, каждый из которых завершается удалением растворов из планшета и промыванием его буфером с добавлением детергента. Основой гетерогенного ИФА является прикрепление иммунореагентов - антигенов или антител - к твердой фазе с сохранением их иммунной активности. Неприсоединившиеся компоненты удаляют в процессе обязательной процедуры отмывания после каждого этапа анализа. В ходе проведения ТИФА к иммунореагентам «сидящим» на твердой фазе, присоединяются комплементарные антигены или антитела. В результате, согласно поставленной задаче, на твердой фазе образуется многослойные иммунные комплексы. Затем образовавшиеся иммунные комплексы метят ферментом, входящим в состав конъюгата, и на заключительном этапе анализа выявляют с помощью хромогенной субстратной смеси. Твердофазные иммуноферментные системы благодаря их высокой чувствительности и методической простоте очень удобны для обнаружения иммунных комплексов, определения изотипов антител, систематической принадлежности микроорганизмов для лабораторной диагностики различных инфекционных болезней и пр.
В качестве твердой фазы для проведения ТИФА используют такие материалы, как полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, целлюлоза, нитроцеллюлоза, нейлон, гели декстрана, полиакриламида, агарозы и др. Твердая фаза может быть в виде пробирок, планшетов для микротитрования, шариков, пленок и др., но в настоящее время чаще всего используют пластиковые планшеты для титрования с 96 лунками, имеющими плоское дно. Такие планшеты удобны как в работе, так и при оценке полученных результатов на специальных спектрофотометрах.
18. Иммунологические методы, основанные на индикации белков и других биомолекул
Реакция агглютинации – склеивание и выпадение в осадок бактерий, под влиянием антител в середе с электролитом. В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клеки, эритроциты и другие корпускулярные антигены) , которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.
Реакция преципитации: при взаимодействии растворимого антигена с антителом в присутствии электролитов (NaCl) образуется комплекс Аг-Ат в виде нерастворимого преципитата. РП применяют в двух целях: выявление антигенов с помощью известной иммунной сыворотки или антител с использованием известных антигенов. С помощью РП определяют фальсификацию рыбных и мясных изделий.
ИФА – это серологическая реакция, в которой для визуализации образовавшегося комплекса антиген-антитело используются ферменты-метки (пероксидаза хрена или щелочная фосфотаза). Эти маркерные (индикаторные) ферменты способны расщеплять субстрат и вызывать изменение цвета среды.
Реакция непрямой (пассивной) гемагллютинации (РПГА). В РПГА выявляет антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами. Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки. РПГА ставят в пластиковых планшетках или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум. Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикум – эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Например, можно обнаружить ботулинический токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулиническй диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой гемагглютинации (РОНГА)).
Сэндвич-вариант иммуноферментного анализа
Этот вариант ИФА является крайне распространенным для определения антигенов, обладающих более чем одной детерминантой.
В процессе анализа антиген как бы «зажат» между молекулами антител, что и обусловило название метода.
Основным достоинством «сэндвич» ИФА является высокая чувствительность, превышающая возможности других схем твердофазного варианта анализа.
Ограничением применения «сэндвич» ИФА является невозможность определения моновалентных антигенов (стероидных гормонов, антгельминтиков, антибиотиков и т.д.) или антигенов, у которых детерминанты расположены на недостаточном расстоянии друг от друга для того, чтобы две молекулы антител могли независимо их связывать.
19. Гетерогенные и гомогенные методы постановки иммуноферментного анализа . Гомогенные методыЕсли все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных
В основе гомогенного метода, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.
Гетерогенные методы
Для гетерогенных методов характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся на разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а не прореагировавшие комплексы - в растворе.Гетерогенные методы в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.
20. Оборудование и реактивы, необходимые для проведения иммуноферментного анализа
96-луночный планшет для проведения иммунологических исследований, антиген, бычий сывороточный альбумин, забуференный физиологический раствор, дозаторы с переменным объемом, лабораторная посуда и дозаторы.Также для промывки раствор PBS-Tween. Для инкубации термостат при 37С. Антивидовой конъюгат. Раствор субстрата фермента. Для остановки реакции использовать стоп-реагент. Спектрофотометр – для детекции результата.
21. Экспресс тесты для диагностики болезней животных и человека. Преимущества и недостатки.
Классические иммуноферментные тест-системы выпускаются в виде готовых к применению комплектов с набором реагентов, для проведения исследований требовалось дополнительное лабораторное оборудование, квалифицированный персонал с навыками работы, особые условия режима работы лаборатории.
«Быстрые» тесты предусматривают получение результатов анализа в течение 15 – 20 минут.
Для производства экспресс-тестов применяются чаще всего следующие технологии: метод иммунохроматографии (латеральной диффузии), метод иммунофильтрации-мембранные устройства для концентрации иммунного материала (проточные), метод латекс-агглютинации , модифицированный метод ИФА – иммуно-дот
Для получения «простых» тестов применяется технология получения сорбированных антигенами возбудителя латекс-частиц, которые используются для метода агглютинации частиц при связывании со специфическими антителами или мембранный метод . при котором антигены сорбированы на специальной мембране, где они связываются со специфическими антителами. .
При использовании метода латекс-агглютинации или мембранного метода в качестве исследуемого материала используется только плазма или сыворотка крови.
Дот – анализ -для концентрации антигенов используют твёрдофазный носитель и иммобилизацию антител к ВИЧ на пористой мембране. Проба проходит через мембрану и адсорбируется на набивке. Анализы выполняются в несколько этапов путём добавления пробы, промывки буферами и сигнальным реактивом. Используемый материал плазма или сыворотка крови. Комплект должен храниться при определённом температурном режиме в холодильнике.
Иммунохроматографические диагностические тесты являются позднейшей разработкой отвечающей всем требованиям и наиболее широко используемыми в мире для получения одноразовых экспресс – тестов. Постановка теста максимально упрощена - требуется только внести исследуемый материал в соответствующую ячейку. Реакция протекает в один этап, так как иммунохроматографическая мембрана (в виде полоски) содержит антигены и соответствующий конъюгат для взаимодействия с исследуемой сывороткой. Результат анализа выявляется в виде окрашенных полос или пятен в областях контроля реакции и теста. Большинство быстрых тестов, основанных на иммунохроматографии, не требуют никаких дополнительных приспособлений и не нуждаются в в холодильнике при хранении и транспортировке. Результаты теста готовы в течении 15 – 20 минут. Для постановки реакции можно обойтись малым количеством исследуемого материала, достаточно одной капли крови из пальца.
Преимущества: не требуется квалифицированный персонал, не требуется дополнительное обороудование, просты в эксплуатации и хранении.
Недостатки: являются лишь качественным методом анализа.
22. Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов
 
В биотехнологии используются как клетки эукариотов, из которых наиболее используемыми являются одноклеточные дрожжи Sacharomyces cerevisiae  и различные клеточные линии животного происхождения, так и прокариотические клетки, из которых основной «рабочей лошадкой» генной инженерии являются бактерии E.coli, основной объект для клонирования рекомбинантных ДНК, а также бациллы, актиномицеты, которые являются продуцентами антибиотиков, коринебактерии, на основе которых разработаны штаммы-продуценты важнейших аминокислот.Биотехнология включает многие традиционные процессы, давно известные и давно используемые человеком. Это пивоварение, хлебопечение, изготовление вина, производство сыра, приготовление многих восточных пряных соусов, а также разнообразные способы утилизации отходов. Во всех перечисленных процессах использовались биологические объекты (пусть даже без достаточных знаний о них) и все эти процессы на протяжении многих лет совершенствовались, правда эмпирически. Начало этого этапа биотехнологии теряется в глубине веков и он продолжался примерно до конца XIX в.
Работы великого французского ученого Луи Пастера (1822–1895) заложили фундамент практического использования достижений микробиологии и биохимии в традиционных биотехнологиях (пивоварение, виноделие, производство уксуса) и ознаменовали начало нового, научного периода развития биотехнологии. Для этого периода характерно развитие промышленной биотехнологии, в особенности ферментационных процессов в промышленных масштабах. Были  разработаны стерильные процессы производства путем ферментации ацетона, глицерина. Интенсивно изучаются основные группы микроорганизмов – возбудителей процессов брожения, исследуются биохимические особенности данных процессов. После открытия
Александром Флемингом пенициллина разрабатываются процессы и аппараты для глубинного культивирования продуцентов, что резко удешевило производство данного антибиотика, и он стал доступным для широкого использования в клинической практике во время второй мировой войны.
После войны быстрыми темпами развивались процессы ферментации для производства антибиотиков, стероидных гормонов, а в 1961 г. возник журнал «Биотехнология и биоинженерия» и снова термин «биотехнология» стал применяться для обозначения процессов, которые относили к области промышленной микробиологии. Однако термин «биотехнология» в большей степени стал ассоциироваться с новым этапом развития этой науки, начало которому положено в 1973 г., когда Стэнли Коэн и Герберт Бойер получили рекомбинантные плазмиды и произвели трансформацию ими клеток E.coli. В течение четырех лет после открытия рекомбинантных ДНК- технологий появились штаммы бактерий, продуцирующие инсулин и человеческий гормон роста. Это привело к притоку инвестиций в новые компании. В настоящее время в США только микробная (основанная на культивировании генетически модифицированных микроорганизмов) биотехнология представлена 1300 компаниями, насчитывающими 153 000 служащих, с годовым доходом 19,6 млрд долл. и с продажами 13,4 млрд долл. В Канаде 282 компании с годовым доходом 1,1 млрд долл., В Японии с годовым доходом 10,0 млрд долл., в Европе 1178 компаний (45 000 служащих) с годовым доходом 3,7 млрд долл. Основные продукты,  получаемые с помощью микроорганизмов и рекомбинантных ДНК-технологий – животные пептиды, такие как гормоны, факторы роста, ферменты, антитела и биологические модификаторы иммунного ответа. По приблизительной оценке, общемировая рыночная стоимость растениеводческой продукции, полученной на основании ДНК- технологий, достигла к 2010 г. почти 40 млрд. долларов. Мировой рынок биотехнологической продукции составляет ежегодно около 150 млрд. долл.
Независимо от природы объекта, начальным этапом биотехнологической разработки является получение чистых культур клеток. Дальнейшие этапы манипуляции с этими культурами характеризуются единообразием подходов, основанных на классических методах микробиологии.
Велик и многообразен мир микробов. К ним относятся все прокариоты — бактерии, актиномицеты, риккетсии и часть эукариот — дрожжи, нитчатые грибы, простейшие и водоросли. Их общее свойство — малые размеры, вследствие чего они видимы лишь в микроскоп. В настоящее время известно более 100 тыс. различных видов микроорганизмов. Многих еще предстоит выявить. При столь большом разнообразии микроорганизмов как провести правильный подбор именно тех форм, продукция которых нас интересует? Как отобрать продуцентов витамина B12 или треонина, эритромицина или декстрана, холестериноксидазы или метана?
Для решения подобных задач проводится выделение микроорганизмов. Отбираются пробы из мест, где обитание того или иного продуцента наиболее вероятно. Применительно к углеводородокисляющим микроорганизмам таким местом может быть почва возле бензоколонок, винные дрожжи обильно встречаются на винограде, анаэробные целлюлозоразлагающие и метанобразующие микроорганизмы в больших количествах обитают в рубце жвачных животных. Образцы проб вносят в жидкие питательные среды специального состава. Эти среды называют элективными: в них путем варьирования различных факторов создаются избирательные условия для преимущественного развития интересующего нас продуцента. К этим факторам относятся источники энергии, углерода, азота, значения рН, температура, осмотическое давление и т. д. Для накопления продуцента холестериноксидазы используют среды с холестерином в качестве единственного источника углерода; углеводородокисляющих микроорганизмов — среды с парафинами; продуцентов протеолитических или липолитических ферментов — среды, содержащие белки или липиды. Так получают накопительные культуры микроорганизмов.
Следующий этап — выделение чистых культур. Для этого используют плотные питательные среды, на которые засевают образцы проб из накопительных культур. Отдельные клетки микроорганизмов на плотных питательных средах образуют изолированные колонии, при их последующем пересеве получаются чистые культуры продуцента, состоящие из популяций клеток одного вида.
Существует и другой путь подбора микроорганизмов — из имеющихся коллекций микроорганизмов. При этом руководствуются опытом, накопленным в результате изучения физиологии и биохимии различных групп микроорганизмов: продуцентов антибиотиков чаще всего находят среди актиномицетов, внеклеточное выделение гидролитических ферментов характерно для грамположительных бактерий, типичные продуценты этанола — дрожжи и т. д.
Способность синтезировать целевой продукт является главным критерием при отборе продуцентов. Однако микробиологическая промышленность предъявляет к продуцентам ряд других требований, важных с точки зрения технологии производства. Микроорганизмы должны: 1) обладать высокой скоростью роста; 2) использовать для жизнедеятельности дешевые непищевые субстраты; 3) быть устойчивыми к заражению посторонней микрофлорой. Все это позволяет значительно снизить затраты на производство целевого продукта.
Одноклеточные организмы, как правило, характеризуются более высокими скоростями синтетических процессов, чем высшие формы живого. Так, корова массой 500 кг в течение одних суток синтезирует около 0,5 кг белка. Такое же количество белка за одни сутки можно получить с помощью 5 г дрожжей. Столь высокие скорости роста характерны, однако, не для всех микроорганизмов. Существуют так называемые олиготрофные микроорганизмы, растущие крайне медленно. Они мало изучены, но представляют значительный интерес как возможные продуценты различных веществ. Поэтому исследование факторов, регулирующих рост культур, оптимизация условий выращивания продуцентов имеют большое теоретическое и практическое значение в биотехнологии.
Особый интерес как объекты биотехнологических разработок представляют фотосинтезирующие микроорганизмы. Они используют в своей жизнедеятельности энергию света, синтезируют разнообразные вещества клеток в результате восстановления углекислоты, сопряженного с окислением воды (цианобактерии и эукариоты), способны к усвоению атмосферного азота (прокариоты), т.е. обходятся самыми дешевыми источниками энергии, углерода, восстановительных эквивалентов и азота. Преимущества фотосинтетиков очевидны перед традиционными в настоящее время объектами биотехнологии — микроорганизмами, энергетические и конструктивные потребности которых обеспечиваются органическими соединениями. Фототрофные микроорганизмы перспективны как продуценты аммиака, водорода, белка и различных биопрепаратов. Большое будущее ожидает фотосинтетиков на пути генетической инженерии в связи с созданием новых технологий микробиологического производства на основе биоконверсии солнечной энергии (С. В. Шестаков, 1984). Прогресс в этой области сдерживается недостатком фундаментальных знаний по генетике и молекулярной биологии фототрофов.
Выгодным объектом для биотехнологии являются термофильные микроорганизмы. Они оптимально растут при высоких температурах (60—80°С, отдельные представители до 110°С и выше, в подводных выбросах сверхгорячих вод на больших океанических глубинах найдены микроорганизмы, способные развиваться под давлением при температурах до 300°С), что затрудняет развитие посторонней микрофлоры. Среди термофилов обнаружены ценные продуценты спиртов, аминокислот, ферментов, молекулярного водорода. Применение термофилов позволяет снизить затраты на стерилизацию промышленного оборудования. Кроме того, скорость роста и метаболическая активность у этих организмов в 1,5—2 раза выше, чем у мезофилов (температурный оптимум развития составляет 20—45°С). Ферменты, синтезируемые термофилами, в частности протеазы Thermus caldophilus или Т. aquaticus, имеют высокую устойчивость к нагреванию, действию окислителей, детергентов, органических растворителей и другим неблагоприятным условиям. В то же время они малоактивны при нормальных температурах. Так, активность протеазы Т. caldophilus при 20°С почти в 100 раз ниже, чем при 75°С. Это свойство имеет прикладное значение, например, в пищевой промышленности. И наконец, еще одно преимущество термофилов связано с затратами на охлаждение биореакторов.
Поскольку реактор для культивирования термофильных микроорганизмов действует при температурах, значительно превышающих температуру окружающей среды, высокий перепад температур способствует быстрой теплоотдаче. Это позволяет применять биореакторы без громоздких теплообменных устройств и тем самым упростить их конструкцию, облегчая аэрацию, перемешивание и пеногашение.
Выделение и подбор объекта — важный этап биотехнологического процесса. Однако путем простого подбора не удается получить высокоактивных продуцентов, поэтому возникает задача изменения природы организма в нужном направлении. Для этого используют методы селекции. С их помощью получены промышленные штаммы микроорганизмов, синтетическая активность которых превышает активность исходных штаммов в десятки и сотни раз. А генеральным путем селекции является сознательное конструирование геномов на каждом этапе отбора нужного продуцента. Такая ситуация не всегда могла быть реализована, вследствие отсутствия эффективных методов изменения геномов селектируемых организмов. В развитии микробных технологий в свое время сыграли (да и сейчас еще продолжают играть!) очень важную роль методы, базирующиеся на селекции спонтанно возникающих измененных вариантов, характеризующихся нужными полезными признаками. При таких методах обычно используется ступенчатая селекция: на каждом этапе отбора из популяции микроорганизмов отбираются наиболее активные варианты (спонтанные мутанты), из которых на следующем этапе отбирают новые, более эффективные штаммы. И так далее. Несмотря на явную ограниченность данного метода (приема), заключающуюся в низкой частоте возникновения мутантов, возможности его рано считать полностью исчерпанными.
Процесс селекции наиболее эффективных продуцентов значительно ускоряется при использовании метода индуцированного мутагенеза. В качестве мутагенных воздействий применяются УФ, рентгеновское и гамма-излучения, определенные химические вещества и др. Однако и этот прием также не лишен недостатков, главным из которых является его трудоемкость и отсутствие сведений о характере изменений, поскольку экспериментатор ведет отбор по конечному результату. Например, устойчивость организма к ионам тяжелых металлов может быть связана с подавлением системы поглощения данных катионов бактериальной клеткой, активацией процесса удаления катионов из клетки или перестройкой системы (систем), которая подвергается ингибирующему действию катиона в клетке. Естественно, знание механизмов повышения устойчивости позволит вести направленное воздействие с целью получения конечного результата  за более короткое время, а также селектировать варианты, лучше подходящие к конкретным условиям производства.
Таким образом, тенденцией сегодняшнего дня является сознательное конструирование штаммов микроорганизмов с заданными свойствами на основе фундаментальных знаний о генетической организации и молекулярно-биологических механизмах осуществления основных функций организма. Короче говоря, применение перечисленных подходов в сочетании с приемами классической селекции является сутью современной селекции микроорганизмов-продуцентов.
Селекция микроорганизмов для микробиологической промышленности и создание новых штаммов часто направлены на усиление их продукционной способности, т.е. образование того или иного продукта. Решение этих задач в той или иной степени связано с изменением регуляторных процессов в клетке, поэтому в настоящем разделе имеет смысл несколько задержаться на возобновлении сведений о регуляции биохимической активности бактериальной клетки.
Как известно, изменения скорости биохимических реакций у бактерий может осуществляться по крайней мере двумя путями. Один из них очень быстрый (реализующийся в течение секунд или минут) заключается в изменении каталитической активности индивидуальных молекул фермента. Второй, более медленный (реализуется в течение многих минут), состоит в изменении скоростей синтеза ферментов. В обоих механизмах используется единый принцип управления системами – принцип обратной связи, хотя существуют и более простые механизмы регуляции активности метаболизма клетки. 
Большие перспективы в селекции продуцентов открывает генетическая инженерия, методы которой позволяют заменять регуляторные области катаболических оперонов на более эффективные промоторы, повышающие продукцию клетками биологически активных веществ и обеспечивающие новые возможности контроля активности генов.
Суть этой технологии заключается в фрагментировании молекул ДНК в строго определенных участках, воссоединении таких фрагментов,     т. е. в создании новых рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Замечательным является то обстоятельство, что все матричные процессы основаны на узнавании ферментами клетки только участков начала и конца процесса. Для копирующих матрицу или работающих на матрице ферментов последовательность нуклеотидов между сигналами начала и конца процесса безразлична. Ситуация, при которой в структурный ген внедрена дополнительная чужеродная ДНК, способная реплицироваться, транскрибироваться и транслироваться в виде нового гибридного («химерного») белка, показана на рисунке 5.1. Так как ДНК различных организмов однотипна, вышеописанная техника не имеет ограничений, связанных с видом и родом организма. Иными словами, сегодня возможен перенос генов любого организма в любой другой организм. Учитывая специфику данной книги, мы будем рассматривать только перенос генов в микроорганизмы и в основном те аспекты такого переноса, которые могут оказаться важными для создания промышленно полезных штаммов-продуцентов. Мы не будем рассматривать подробно технику генной инженерии, которая хорошо описана в литературе. Тем не менее следует сказать несколько слов о тех основных элементах, без которых генно-инженерные манипуляции невозможны.
В первую очередь необходимо иметь хорошо отработанную систему хозяин — вектор. Под вектором понимается, как правило, небольшая молекула ДНК, способная к автономной репликации в определенном микроорганизме. Это может быть бактериофаг или плазмида. Естественно, необходимо иметь эффективный способ введения векторной и рекомбинантной молекулы в микроорганизм. Векторные молекулы должны обладать рядом свойств, позволяющих удобное введение чужеродной ДНК и ее последующую экспрессию. В настоящее время векторные системы очень хорошо разработаны для такой бактерии, как Escherlchla coll. Задача прикладной микробиологии — освоение систем хозяин — вектор для промышленных микроорганизмов: бацилл, псевдомонад, актиномицетов, дрожжей и др.
Приемы конструирования штаммов методами генной инженерии во многом зависят от целей промышленности. Наиболее ясная и лучше всего разработанная задача — это производство методами микробиологического синтеза белков человека, важных для медицины, или белков сельскохозяйственных животных для целей ветеринарии. С точки зрения генной инженерии эта задача сводится к введению чужеродного гена в удобный для промышленного производства микроорганизм и оптимизации его экспрессии.
Основной путь получения рекомбинантного антигена – введение гена отвечающего за продуцирование антигена в организм продуцента с помощью вектора. Частая проблема этих антигенов в том, что они не всегда сохраняют свои свойства после синтеза бактерией из-за различий в третичной структуре и гликолизирования.
23. Принципы конструирования и технология сборки иммунохроматографических тестов (ИХА-тестов)
Устройство внутренней части тест-кассеты в области одной мембраны:
1) накладка для образца, на которую первоначально поступают проба и буфер (аналитический раствор);
2) конъюгатная накладка с сорбированным конъюгатом нанноколлоидного золота (хромогена) с антителами или белком А оболочки вируса;
3) мембрана с иммобилизованными в зоне теста и зоне контроля моноклональными антителами, поликлональными антителами или рекомбинантным антигеном, на которой происходит фиксация иммунных комплексов;
4) абсорбентная накладка, впитывающая растворы на последнем этапе исследования.
Нанесение компонентов на мембраны и сборка тест-системы
Для аналитической зоны используют моноклональные или поликлональные антитела к определяемому антигену, для контрольной зоны антивидовые антитела. Использование МкАТ предпочтительнее, так как они обеспечивают большую специфичность анализа. Все растворы, наносимые на мембраны, могут быть приготовлены заранее, при этом храниться они должны при 4 С. На аналитическую нитроцеллюлозную мембрану, наклеенную на пластиковую основу, наносят раствор специфических антител в фосфатном солевом буфере для формирования аналитической зоны и раствор антивидовых антител для формирования контрольной зоны, высушивают в течение 24 ч при 37 С, относительной влажности % и хранят при комнатной температуре в герметично закрытой упаковке. Растворы конъюгатов антител с НЧКЗ наносят на мембраны и высушивают на воздухе при комнатной температуре. Не допускается хранение готовых мембран с нанесенными реагентами при отрицательных температурах, а также нагревание, даже кратковременное, до температур выше 35 С. На подложку с аналитической мембраной последовательно наклеивают мембрану с иммобилизованным конъюгатом, впитывающую мембрану, мембрану для образца и режут на тестполоски
24. Биосенсоры и биочипы. Принципы создания и область применения.
В  конце  прошлого  столетия  в  России  и  США  было  разработано  высокочувствительное  миниатюрное  устройство  —  биочип.  Ему  нашли  широкое  применение  в  области  ветеринарии,  криминалистики;  в  медико-биологических  исследованиях;  в  биотехнологии,  а  также  для  идентификации  вирусов  и  микроорганизмов  и  определения  биоактивных  веществ  в  небольших  концентрациях.
Биочип  —  матрица  с  встроенными  биологическими  макромолекулами,  которые  способны  избирательно  связывать  вещества  в  исследуемом  растворе.  Это  мини-устройство  представляет  собой  обычно  стеклянную  или  пластиковую  пластину  с  микротестами  на  основе  ДНК  или  белков.
Технология  микрочипов  нашла  широкое  применение  в  связи  с  высокой  чувствительностью,  специфичностью,  простотой  выполнения  и  широким  спектром  анализа,  и,  конечно,  низкой  стоимостью  проведения  процедуры. 
ДНК-чипы  представляют  собой  твердую  платформу,  на  которой  сгруппировано  в  виде  точек  большое  число  дезоксиолигонуклеотидов.  Материал  подложки  может  состоять  из  стекла,  кремния,  гидрогеля,  мембранных  фильтров  и  различных  полимеров.  ДНК-чипы  способны  распознавать  последовательности  ДНК  с  заданными  свойствами.  Принцип  работы  биологических  чипов  основан  на  взаимодействии  комплементарных  цепей  ДНК.  Посредством  гибридизации  происходит  процесс  узнавания  ДНК-мишеней  с  ДНК-пробами.  Биочип,  с  которым  проведена  гибридизация,  представляет  собой  скопление  светящихся  точек.  Рассмотреть  их  можно  только  при  помощи  специальных  сканеров,  отличающихся  спектральной  чувствительностью  и  диапазоном.
Белковые  и  пептидные  чипы.
Для  изучения  взаимодействия  между  белками  используют  белковые  чипы.  Технология  белковых  чипов  основа  на  специфическом  узнавании  антигена  и  антитела.  Чипы  нашли  большое  применение  в  медицине  для  выявления  скрытого  периода  аллергии  и  определения  аллергенов,  а  также  для  анализа  таких  жидкостей,  как  плазма  крови,  ликвор,  амниотическая  жидкость,  моча,  слюна  и  т.  д.  Биочипы  также  используют  при  диагностике  физиологических  либо  патологических  изменений,  основываясь  на  модификации  белков.  Поскольку  белковые  чипы  включают  в  себя  основные  антигены  патогенных  организмов,  то  при  помощи  данных  чипов  можно  проводить  анализ  крови  на  присутствие  одновременно  сотен,  и  даже  тысяч  антител  и  быстро  идентифицировать  инфекции.
Углеводные  микрочипы
Примером  углеводного  микрочипа  может  служить  комплекс  гликолипидов  с  нитроцеллюлозой  или  поливинилиденфторидом.  Благодаря  данным  чипам  можно  без  особо  труда  определить  последовательность  неизвестных  олигосахаридов,  опираясь  на  структуру  вступивших  с  ними  в  связь  белков.  И,  наоборот,  по  взаимодействию  сахаров  с  мембраной  можно  идентифицировать  неизвестные  белки .В  практическом  отношении  применение  микрочипов  позволяет:
·     ставить  точный  диагноз  болезни:  до  ее  начала  или  на  начальной  стадии  её  развития
·     прогнозировать  развитие  болезни,  ее  исход;
·     находить  вирусы  или  бактерии;
·     определять  нахождение  в  организме  раковых  клеток;
·     проводить  изучение  химических  соединений  для  исследования  их  лекарственных  свойств;
Существует  несколько  способов  изготовления  биочипов.
Метод  фотолитографии.
Таким  способом  чипы  наращивают  из  стеклянных  пластинок  с  использованием  микромасок.  Причем  на  каждом  таком  чипе  расположено  до  нескольких  десятков  тысяч  уникальных  фрагментов  ДНК.  Затем  полученный  биочип  гибридизуют  с  ДНК.
Есть  и  другой  подход  к  изготовлению  микрочипов,  когда  готовые  последовательности  однонитевой  ДНК  пришивают  к  чипу.
Наличие  в  устройстве  биоматериала  позволяет  без  труда  определять  нужные  соединения  в  смеси,  не  прибегая  к  дополнительным  операциям,  поэтому  в  настоящее  время  процесс  определения  качества  донорской  крови,  обнаружения  спор  сибирской  язвы,  проведения  криминалистических  анализов,  выявления  начальной  стадии  онкологических  заболеваний  менее  трудоемок  и  занимает  считанные  часы.
В  биотехнологии  можно  встретить  такое  понятие,  как  биосенсор.
Биосенсор  —  аналитическое  устройство,  в  преобразователь  которого  встроен  биоматериал,  находящийся  в  непосредственном  с  ним  контакте. 
Биосенсор  состоит  из  5  основных  компонентов:
·     анализируемого  вещества;
·     биохимического  преобразователя  —  превращает  информацию  о  физических/химических  связях  в  сигнал;
·     физического  преобразователя  —  фиксирует  сигнал  от  биологической  системы  распознавания;
·     электроники,  отвечающей  за  отображение  результатов  в  доступной  форме.
Выделяют  два  вида  биосенсоров:
1.  Биоафинные-свойства  молекул  биодатчика  меняются  вследствие  взаимодействия  молекул  биоселективного  элемента  с  молекулами  исследуемого  раствора.  Изменения  свойств  датчика  представляют  собой  «сигнал»,  пропорциональный  концентрации  анализируемой  смеси.
2.  Фермент-метаболические  БС  —  образование  сигнала  обусловлено  результатом  взаимодействия  фермента  с  субстратом.
Выделяют  оптические,  акустические,  электрохимические  и  термические  биосенсоры.  Основным  критерием  данной  классификации  является  тип  преобразователя.
Оптические  биосенсоры  –  устройства,  основанные  на  явлениях  люминесценции,  поглощения,  рассеивания,  поляризации  или  преломления  света.
По  оптическим  каналам  и  светодиодам  передается  порождаемый  биохимическим  преобразователем  первичный  сигнал  в  виде  света.  Оптические  биосенсоры  помехоустойчивы  к  электромагнитному  фону,  однако  они  подвержены  фотовыцветанию  и  вымыванию  индикатора.  Большим  достоинством  данного  типа  биосенсоров  является  то,  что  их  можно  устанавливать  в  опасных  и  вредных  для  здоровья  условиях.  Фитохром,  зрительный  родопсин,  бактериородопсин  используются  в  качестве  светочувствительных  БС. 
Интерес  к  биосенсорам  растет.  Они  получили  большое  распространение  в  биотехнологии.  В  настоящее  время  ведется  разработка  по  увеличению  срока  службы  термически  неустойчивых  биосенсоров.
25. Реакции, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител. Приведите примеры.
Реакция агглютинации – склеивание и выпадение в осадок бактерий, под влиянием антител в середе с электролитом. В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клеки, эритроциты и другие корпускулярные антигены) , которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.
Реакция преципитации: при взаимодействии растворимого антигена с антителом в присутствии электролитов (NaCl) образуется комплекс Аг-Ат в виде нерастворимого преципитата. РП применяют в двух целях: выявление антигенов с помощью известной иммунной сыворотки или антител с использованием известных антигенов. С помощью РП определяют фальсификацию рыбных и мясных изделий.
ИФА – это серологическая реакция, в которой для визуализации образовавшегося комплекса антиген-антитело используются ферменты-метки (пероксидаза хрена или щелочная фосфотаза). Эти маркерные (индикаторные) ферменты способны расщеплять субстрат и вызывать изменение цвета среды.
Реакция непрямой (пассивной) гемагллютинации (РПГА). В РПГА выявляет антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами. Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки. РПГА ставят в пластиковых планшетках или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум. Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикум – эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Например, можно обнаружить ботулинический токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулиническй диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой гемагглютинации (РОНГА)).
Вопросы рубежного контроля №2по дисциплине
«Современные методы в биотехнологии»
Цели и задачи генетической инженерии.
Генная инженерия — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого организма.
Цель генной инженерии – получение клеток, способных в промышленных масштабах нарабатывать некоторые белки, свойственные человеку. Достижение этой цели поможет избавить человечество от многих болезней, от которых в настоящее время нет лекарств. Этот процесс уже начался и принёс первые положительные результаты.
Задачи генной инженерии. Основные направления генетической модификации организмов:
– придание устойчивости к ядохимикатам (например, к определенным гербицидам);
– придание устойчивости к вредителям и болезням (например, Bt-модификация);
– повышение продуктивности (например, быстрый рост трансгенного лосося);
– придание особых качеств (например, изменение химического состава).
Методы генетической инженерии. Основные достижения генетической инженерии.
Методы генной инженерии основаны на получении фрагментов исходной ДНК и их модификации. Для получения исходных фрагментов ДНК разных организмов используется несколько способов:
– Получение фрагментов ДНК из природного материала путем разрезания исходной ДНК с помощью специфических нуклеаз (рестриктаз).
– Прямой химический синтез ДНК, например, для создания зондов.
– Синтез комплементарной ДНК (кДНК) на матрице мРНК с использованием фермента обратной транскриптазы (ревертазы).
Выделенные участки ДНК встраивают в векторы переноса ДНК. Векторы ДНК – это небольшие молекулы ДНК, способные проникать в другие клетки и реплицироваться в них.
В состав вектора ДНК входит не менее трех групп генов:
1. Целевые гены, которые интересуют экспериментатора.
2. Гены, отвечающие за репликацию вектора, его интеграцию в ДНК клетки-хозяина и экспрессию требуемых генов.
3. Гены-маркеры (селективные, репортерные гены), по деятельности которых можно судить об успешности трансформации (например, гены устойчивости к антибиотикам или гены, отвечающие за синтез белков, светящихся в ультрафиолетовом свете).
Для внедрения векторов в прокариотические или эукариотические клетки используют различные способы, например:
1. Биотрансформация. Используются векторы, способные сами проникать в клетки. Частным случаем биотрансформации является агробактериальная трансформация.
2. Микроинъекции. Используются, если клетки, подлежащие трансформации, достаточно крупные (например, икринки, пыльцевые трубки).3. Биобаллистика (биолистика). Векторы «вбивают» в клетки с помощью специальных «пушек».
4. Комбинированные методы, например, сочетание агробактериальной трансформации и биолистики.

В качестве векторов часто используют плазмиды (кольцевые молекулы ДНК прокариотических клеток), а также ДНК вирусов. У эукариот в качестве векторов используют мобильные генетические элементы – участки хромосом, способные образовывать множество копий и встраиваться в другие хромосомы. В составе одного вектора можно комбинировать различные фрагменты ДНК (различные гены). Вновь образованные фрагменты ДНК называют рекомбинантными.
Векторы переноса ДНК вместе с внедренными фрагментами ДНК различными способами вводят в прокариотические или эукариотические клетки и получают трансгенные клетки. В ходе размножения трансгенных клеток происходит клонирование требуемых фрагментов ДНК, в частности, отдельных генов. Клонированные гены эукариот подвергают различным модификациям (например, добавляют перед ними определенные промоторы) и внедряют в клетки-продуценты. Основная проблема состоит в том, чтобы чужеродные гены экспрессировались постоянно, то есть должен происходить синтез необходимых веществ без ущерба для клетки–хозяина.
Практические достижения современной генной инженерии заключаются в следующем:
– Созданы банки генов, или клонотеки, представляющие собой коллекции клонов бактерий. Каждый из этих клонов содержит фрагменты ДНК определенного организма (дрозофилы, человека и других).
– На основе трансформированных штаммов вирусов, бактерий и дрожжей осуществляется промышленное производство инсулина, интерферона, гормональных препаратов. На стадии испытаний находится производство белков, позволяющих сохранить свертываемость крови при гемофилии, и других лекарственных препаратов.
– Созданы трансгенные высшие организмы (многие растения, некоторые рыбы и млекопитающие) в клетках которых успешно функционируют гены совершенно других организмов. Широко известны генетически защищенные генно-модифицированные растения (ГМР), устойчивые к высоких дозам определенных гербицидов, а также Bt-модифицированные растения, устойчивые к вредителям. Среди трансгенных растений лидирующие позиции занимают: соя, кукуруза, хлопок, рапс.
Общие понятия о трансгенах и трансгенных организмах. Методы получения трансгенных животных. В настоящее время животное, чей генотип был изменён введением чужеродной ДНК называют трансгенным, водимую ДНК – трансгеном, а весь процесс – трансгенной технологией или трансгенозом.
Развитие генной инженерии, позволяющей целенаправленно создавать новые ДНК – носители генетической информации и встраивать их в геном клетки, которая могла бы дать начало клеткам зародышевой линии, открывает новые перспективы в генетической модификации животных.
Метод получения трансгенных животных включает следующие этапы:
1) выбор, получение и клонирование чужеродного гена; 2) получение зигот и выявление пронуклеусов; 3) микроинъекция определенного числа копий генов в видимый пронуклеус; 4) трансплантация зиготы в половые пути гормонально подготовленной самки; 5) оценка родившихся .животных по генотипу и фенотипу: интеграция чужеродной ДНК, экспрессия ДНК, влияние на признак (например, высокая интенсивность роста), установление наследования гена.
Технология создания трансгенных растений. Основные методы получения трансгенных растений устойчивых к биотическим и абиотическим факторам.
Процесс получения трансгенных растений начинается с введения требуемых генов в недифференцированные клетки таким образом, чтобы они интегрировались в хромосомы. Введение чужеродных генов в клетки растений облегчается, если их клеточные стенки удаляют с помощью гидролитических ферментов - пектиназы и(или) целлюлазы, что приводит к образованию протопластов. Чужеродные гены, находящиеся в составе векторных плазмид , вводят в протопласты одним из стандартных способов с использованием эндоцитоза, стимулированного полиэтиленгликолем, электропорации , микроинъекций или бомбардировки микрочастицами, нагруженными векторной ДНК. После этого протопласты в течение нескольких дней культивируют на питательной среде для восстановления клеточных стенок и образующиеся клетки-трансфектанты используют для регенерации целых растений.
Основным направлением применения трансгеноза для генетической модификации культурных растений является повышение их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, в частности вирусам и гербицидам.
Традиционных методов селекции недостаточно, чтобы улучшить генофонд растений в направлении устойчивости к наиболее опасным патогенам; требуются новые подходы, которые в сочетании с классическими методами позволили бы добиваться дальнейших успехов в создании новых устойчивых к биотическим стрессам, особенно к болезням, сортов сельскохозяйственных культур. Один из таких подходов - использование клеток и тканей растений для создания исходного для селекции на устойчивость к инфекционному стрессу материала.
Существуют четыре принципиально различных механизма, которые могут обеспечивать устойчивость к тем или иным химическим соединениям, включая гербициды: транспортный, элиминирующий, регуляционный и контактный. Транспортный механизм устойчивости заключается в невозможности проникновения гербицида в клетку. При действии элиминирующего механизма устойчивости вещества, попавшие внутрь клетки, могут разрушаться с помощью индуцируемых клеточных факторов, чаще всего деградирующих ферментов, а также подвергаться тому или иному виду модификации, образуя неактивные безвредные для клетки продукты. При регуляционной резистентности белок или фермент клетки, инактивирующийся под действием гербицида, начинает усиленно синтезироваться, ликвидируя таким образом дефицит нужного метаболита в клетке. Контактный механизм устойчивости обеспечивается изменением структуры мишени (белок или фермент), взаимодействием с которым связано повреждающее действие гербицида.
5. Клонирование животных. Репродуктивное и терапевтическое клонирование.
Клони́рование (англ. cloning от др.-греч. κλών — «веточка, побег, отпрыск») — в самом общем значении — точное воспроизведение какого-либо объекта любое требуемое количество раз. Объекты, полученные в результате клонирования (каждый по отдельности и вся их совокупность) называются клоном.
Когда вопросы клонирования освещают в новостях, то говорят только об одном его типе - репродуктивном клонировании. Однако существуют различные виды клонирования, а сами технологии клонирования могут быть использованы не только при создании генетического двойника, но и в других целях. Итак, существуют два основных типа клонирования: репродуктивное и терапевтическое. Репродуктивное клонирование - это технология, используемая для получения генетической копии взрослого животного. Именно таким образом была создана знаменитая овечка Долли. В процессе создания клона эмбриона ученые соединяют зрелую донорскую клетку с лишенной генетического материала яйцеклеткой. Когда клонированный эмбрион достигает определенной стадии развития, его помещают в матку реципиентной самки, где он и продолжает развиваться до самого рождения. Успешное клонирование Долли стало научным прорывом. Было доказано, что любая зрелая клетка может послужить в качестве генетического материала для создания нового организма.
При терапевтическом или «эмбриональном» клонировании ученые создают человеческие эмбрионы и используют их в своих исследованиях. Целью этого процесса является не создание человеческих клонов, а выращивание стволовых клеток, которые могут быть использованы в изучении человеческого организма и лечении болезней. Многие исследователи надеются, что в будущем стволовые клетки можно будет использовать в качестве клеток-имплантатов для лечения заболеваний сердца, рака и других болезней.
6. Проблемы клонирования человека: этическая (религиозная), правовая, моральная. Возможные последствия клонирования человека.
7. Молекулярная диагностика. Полимеразная цепная реакция: методы амплификации нуклеиновых кислот, компоненты и условия проведения полимеразой цепной реакции, методы анализа продуктов амплификации.
Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.
Проведение ПЦР
Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp[8]). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований[9].
Компоненты реакции
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза), Thermus thermophilus (Tth-полимераза) и другие.
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.
Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий.
Денатурация
Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется плавлением (денатурацией), так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Обычно перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин для полной денатурации матрицы и праймеров.
Отжиг
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 5 градусов меньше, чем температура плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига — 30 сек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60—72 °C.
Элонгация
ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5'- к 3'-концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин.
На сегодняшний день существует несколько основных способов детекции результатов ПЦР:
z Электрофоретический (в агарозном или полиакрила-мидном геле)
z Гибридизационно – ферментный
z Гибридизационо – флуоресцентный:
– регистрация продукта после окончания реакции ам-плификации – «анализ по конечной точке»;
– детекция продукта в режиме «реального времени».
Метод горизонтального электрофореза
Наиболее распространенным до недавнего времени являлся метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. В этом случае визуализацию результатов проводят в пластине агарозного геля, который представляет собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5-2,5% с добавлением специального красителя ДНК, например бромистого этидия.
Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют лунки, в которые вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения.
Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияют: концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК.
Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, который излучает свет в ультрафиолетовом диапазоне (254 – 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).
Метод гибридизации после амплификации
Другой способ детекции продуктов амплификации основан на гибридизации олигонуклеотидных зондов с продуктами амплификации. Зонды представляют собой искусственно синтезированные участки ДНК, содержащие ту или иную метку, детектируемую специальными приборами.
Для детекции продуктов ПЦР после окончания реакции амплификации необходимо специальное оборудование – детектор флуоресценции (например, приборы «Джин» или «Джин-4» производства НПФ «ДНК-Технология»).
В процессе своей работы прибор регистрирует флуоресцентное излучение, возникающее в реакционной смеси при освещении образца источником возбуждающего света. Регистрация производится последовательно для каждой из пробирок при её позиционировании относительно оптического блока с помощью шагового двигателя.
Флуорофоры для каждой из мишеней (например, для специфического искомого участка ДНК и внутреннего контроля) имеют свою длину волны, это позволяет регистрировать одновременно несколько сигналов по соответствующим каналам, что повышает производительность метода.
Такой подход позволяет свести к минимуму риск контаминации продуктами амплификации. Детекция результатов проводится в закрытых пробирках, что позволяет осуществлять ПЦР-исследования в одной комнате и обходиться меньшим количеством персонала. Кроме того, регистрация, интерпретация и хранение полученных результатов проводятся автоматически.
В результате указанный способ детекции существенно сокращает время проведения анализа и исключает возможность субъективной оценки полученных результатов, что повышает качество работы лаборатории. Тем не менее необходимо помнить, что реализация данного подхода позволяет проводить только качественный анализ.
Метод гибридизации в процессе амплификации
Данный метод, как упоминалось ранее, позволяет учитывать результаты реакции, не открывая пробирки. Регистрация результатов по уровню флуоресценции происходит с помощью специального оборудования.
Ключевым элементом метода является использование гибридизационных олигонуклеотидных зондов, меченных молекулами флуорофора и «темнового» гасителя.
Наиболее часто применяется флуоресцентный краситель 6-FAM (6-карбоксифлуоресцеин), с длинной волны возбуждения 488 нм, который легко связывается с олигонуклеотидами и обеспечивает высокую интенсивность сигнала. Поэтому под анализ с его использованием адаптированы многие приборы.
Также активно применяют SYBR Green I, который при связывании с двухцепочечной ДНК вызывает увеличение флуоресценции. В качестве референсного красителя широко используется ROX.
Для выявления продуктов амплификации применяют следующие наиболее распространенные подходы:
Выщепление 5' концевой метки – метод основан на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входят флуоресцентная метка в 5'-положении, гаситель флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в 3'-положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу.
Использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями – методика отличается от описанной выше тем, что концевые последовательности зонда представляют собой взаимно комплементарные области, а флуорофор и гаситель присоединяют к концевым нуклеотидам. При температуре отжига свободные зонды образуют шпильки за счет наличия комплементарных участков. При этом флуорофор и гаситель оказываются в непосредственной близости, что приводит к тушению флуоресценции.
Для анализа в режиме «реального времени» используют специальные ДНК-амплификаторы с оптическим блоком, позволяющие детектировать флуоресценцию внутри реакционной пробирки в ходе реакции. При амплификации образца детектируемый флуоресцентный сигнал может состоять из трех последовательных участков:
1 – базовая линия (сигнал не превышает предела детектирования прибора);
2 – экспоненциальная амплификация;
3 – плато.
Сигнал флуоресценции в ходе ПЦР возрастает пропорционально количеству продукта амплификации. Мониторинг сигнала позволяет построить кинетическую кривую реакции, при этом, момент заметного увеличения сигнала и отрыва его от фонового – так называемый пороговый цикл – зависит от исходного количества ДНК-мишени. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции и тем меньше пороговый цикл.
Главным преимуществом детекции результатов ПЦР в режиме «реального времени» является возможность проведения количественного анализа.
Применение ПЦР
На данный момент метод ПЦР широко используется в следующих отраслях:
1. Медицина, система санитарно-эпидемиологического контроля
– диагностика инфекций:
z особо опасные и социально значимые инфекции;
z эпидемические инфекции;
z гемотрансмиссивные инфекции;
z оппортунистические инфекции;
z TORCH-инфекции;
z исследование биоценозов;
– диагностика иммунных патологий
– генетические исследования наследственных заболеваний
– определение ГМИ пищевых продуктов
2. Ветеринария и растениеводство
– инфекционные заболевания
– определение видовой принадлежности
3. Наука
– генная инженерия, микробиология, генетика и др.
4. Промышленность
– определение биологического загрязнения (санитарный контроль)
5. Судебная медицина
– идентификация личности
8.Мультиплексная полимеразная цепная реакция. Принцип постановки и область применения метода. Преимущества использования данной системы.
Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР – это процесс коамплификации нескольких ДНК-матриц в одной реакционной смеси с использованием различных пар праймеров.
Мультипраймерная ПЦР используется, например, для одновременного скрининга биопробы сразу по нескольким инфекционным возбудителям. Данный метод позволяет также обнаружить наличие комплекса факторов вирулентности и резистентности к антибактериальным и противовирусным препаратам.
 
Полимеразная цепная реакция характеризуется универсальностью процедуры проведения реакции. Мультиплексная ПЦР проводится также по общей схеме, единственное ее отличие состоит в этапе добавления праймеров: в реакционную смесь вносится более двух праймеров и температура отжига регулируется соответственно.
 
Данный метод может быть реализован как с использованием стандартного оборудования для ПЦР и электрофоретического анализа продуктов амплификации, так и в формате ПЦР в реальном времени. Основными преимуществами реализации этого метода в формате ПЦР в реальном времени являются: высокая скорость, низкая трудоемкость и снижение риска контаминации продуктами ПЦР, что особенно важно при проведении эпидемиологических исследований.
Постановка ПЦР состоит из трех последовательных этапов.
 
1 этап – подготовка пробы биологического материала.
Для подготовки пробы могут быть использованы различные методики, в результате которых происходит либо извлечение ДНК из биопрепарата, либо нейтрализация посторонних примесей в этом биопрепарате. Пробы подготавливают либо обычным кипячением в течение 5-10 минут, либо при помощи проведения ферментативного протеолиза с последующими депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом.
Некоторые методы пробоподготовки основаны на использовании ионообменников, которые сорбируют примеси, ингибирующие процесс ПЦР.
 
2 этап – собственно ПЦР.
В реакционную смесь вводится препарат ДНК, выбранные праймеры, водный раствор дНТФ, буфер для ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) и сама полимераза.
Для амплификации можно использовать подобную программу: после начальной денатурации в течение 1 мин при 950С проводится 25 циклов ПЦР (денатурация при 940С в течение 30 с, отжиг при 50 0С в течение 30 с, синтез при 72 0С в течение 30 с).
 
При использовании формата ПЦР в реальном времени амплификация и измерение количества искомой молекулы ДНК происходят одновременно, для чего используют флуоресцентные красители. В противном случае необходимо отдельное проведение третьего этапа ПЦР.
 
3 этап – детекция результатов ПЦР.
Существует несколько способом детекции:
- электрофоретический (в агарозном или полиакриламидном геле);
- гибридизационно-ферментный;
- гибридизационно-флуоресцентный:
- регистрация после окончания амплификации («анализ по конечной точке»);
- детекция в режиме реального времени.
 
Область применения метода мультиплексной ПЦР
С 1995 года наблюдается увеличение расходов на ПЦР-диагностику, что является показателем роста использования ПЦР в практической медицине. В настоящее время активно развивается пять основных направлений ПЦР-диагностики:
диагностика инфекционных заболеваний;
диагностика онкологических заболеваний;
диагностика генетических заболеваний;
идентификация личности;
диагностика патогенов в пище.
Применение такого молекулярного метода исследования, как мультипраймерная ПЦР, увеличивает частоту обнаружения мутаций, в том числе микромутаций. Это позволяет применять молекулярные методы для мониторинга минимальной остаточной болезни, прогнозирования исхода лечения.
Высокоспецифичные ПЦР-тест-системы используются также при диагностике инфекционных и соматических заболеваний. Существенную роль метод ПЦР играет в диагностике заболеваний, вызываемых возбудителями, бактериологическая идентификация которых не может быть проведена в связи с трудностями их выращивания на искусственных питательных средах, требующих разнообразных добавок или использования культур клеток.Применение мультиплексной ПЦР зачастую упрощает и ускоряет проведение анализов в области клинической диагностики. Например, мультиплексная ПЦР с обратной транскрипцией дает возможность исследовать костный мозг у пациентов с острым лимфолейкозом и острым миелолейкозом на наличие 29 хромосомных аберраций. Использование мультиплексной ПЦР позволило свести постановку к восьми параллельным реакциям ПЦР, что значительно уменьшило объем работ и количество реагентов. С помощью мультиплексной ПЦР можно одновременно обследовать до 10 пациентов в течение нескольких дней.
Т. о., мультиплексная ПЦР может применяться (и активно применяется) при диагностике таких заболеваний, как: сифилис, гонорея, микоплазмы, уреаплазмы, хламидиоз, СПИД, папилломавирусная инфекция, гепатиты, герпес, туберкулез, боррелиоз, кандидоз и другие микозы.9.Технология получения рекомбинантных белков. Этапы. Очистка и характеристика целевого продукта.
Рекомбинантный белок — это белок, состоящий из аминокислотных последовательностей различных природных белков, полученный с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Рекомбинантные белки широко используются для нужд биотехнологий: в медицине для лечения и профилактики заболеваний, в диагностических целях и т.д. 
Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:
- специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;
- быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;
- конструирование рекомбинантной ДНК;
- гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;
- клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;
- введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.
Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью ряда ферментов – прежде всего ферментов рестрикции. В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы [5].
Рестриктазы узнают и расщепляют специфические нуклеотидные последовательности в двухцепочечной молекуле ДНК. Однако одних ферментов рестрикции при молекулярном клонировании недостаточно, так как водородные связи между четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, не столь прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК.
Одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, другая – содержит информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК. 
Наиболее распространенными методами очистки рекомбинантных белков в биотехнологии являются хроматографические методы и, в частности, металлохелатная аффинная хроматография [1, 2, 3]. Один из приемов металлоафинной хроматографии основан на том, что некоторые аминокислоты, в частности гистидин, способны формировать комплексы с ионами металлов. После иммобилизации на хроматографической фазе хелатирующих групп целевой рекомбинантный белок, содержащий блок из нескольких остатков гистидина, связывается с хроматографической фазой, после чего отделяются сопутствующие белки и проводится элюция целевого белка. Кроме блока из остатков гистидина, целевой рекомбинантный белок может содержать последовательности глутатион-S-трансферазы (GST), хитина, S-белка и другие, при этом принципы хроматографического выделения целевого рекомбинантного белка остаются теми же.
К рекомбинантным белкам, применяемым в диагностических целях, предъявляют специальные требования:
высокая степень очистки
точная копия природного белка или научные доказательства безопасности мутаций для пациентов
проверенный, стабильный и безопасный продуцент
как можно более полное удаление всех биополимеров и пирогенов продуцента
Сферы практического применения рекомбинантных белков.
В настоящее время с помощью методов генной инженерии, в том числе и посредством биотехнологии рекомбинантных ДНК (рДНК), клонировано более 500 генов различных белков человека, которые уже являются или могут в скором времени стать ЛС. По подсчетам специалистов ВОЗ, ежегодный объем мирового рынка лекарственных препаратов (ЛП) на основе белков человека составляет порядка 200 млрд долларов, что в целом соответствует 17% общемирового фармацевтического рынка. Следует отметить, что рынок препаратов рекомбинантных белков неуклонно развивается и растет, достигая порядка 19% в год. Следует отметить, что технология рДНК позволяет совершенствовать данную группу ЛП: повышать их фармакологическую активность, уменьшать вероятность развития побочных реакций после их введения в организм человека и т.п.
С помощью данных методов в кишечной палочке (Escherichia coli) достигнута экспрессия порядка 70 протеинов высших эукариот: соматостатина, инсулина, энкефалина, протеинкиназы вируса саркомы Рауса, гормона роста человека, интерферона фибробластов человека, лейкоцитарного интерферона, антигена вируса гепатита В, химозина, гормона роста быка и т.п.
Наглядным примером успехов реализации технологий рДНК в биотехнологии служит производство интерферонов. В настоящее время можно получить любое необходимое количество интерферона для целей клинической практики. Так, с помощью методов биотехнологии можно из 1 л культуры ткани получить порядка 108 ед. интерферона, в то время как 1 л культуры E. coli позволяет получить 1010 ед. рекомбинантного интерферона.
В качестве еще одного примера успешного практического применения рекомбинантных продуцентов следует отметить биотехнологическое производство инсулина. Так, для получения 100 г кристаллического инсулина требуется около 800–1000 кг поджелудочной железы крупного рогатого скота, при этом одна железа коровы весит порядка 200–250 г. В этой связи инсулин в течение долгого времени оставался очень дорогостоящим и труднодоступным препаратом для широкого круга больных сахарным диабетом. Только в 1978 г. исследователи компании «Genentech, Inc.» впервые получили инсулин с помощью специально сконструированного штамма E. coli.
Кроме того, в настоящее время ряд фирм организует производство интерферона с использованием рекомбинантных дрожжей. К преимуществам данного продуцента интерферона в сравнении с E. coli относятся: наличие секреторных систем, благодаря которым можно получить внутриклеточный интерферон, а также отсутствие токсичных веществ, свойственных бактериальному продуценту.В этой связи стало возможным преобразование клеток бактерий, дрожжей, клеточных культур растений и животных в своеобразные «биологические фабрики» для крупномасштабного получения препаратов рекомбинантных белков, т.е. практически любое биотехнологическое производство белков базируется на использовании генетически модифицированных организмов .Вакцины, классификация вакцин. Биотехнология получения вакцинных препаратов.
Вакцины - биологические препараты, приготовленные из возбудителей инфекционных болезней или продуктов их ж/д и содержащие в своем составе специфический антиген в количестве, достаточном для обеспечения иммунитета у вакцинированных животных.
Вакцины делятся:
по направленности применения на:
-противобактерийные,
-противогрибковые,
-противовирусные.
по способности микроорганизмов к размножению (репликации) на:
-живые
-инактивированные, в том числе анатоксины;
по сырьевым компонентам на:
-корпускулярные (у вирусов — цельновирионные);
-субъединичные - вакцины содержащие отдельные компоненты патогенного м/о;
-вакцины из экзопродуктов микроорганизмов (анатоксины).
В зависимости от видовой принадлежности штамма микроорганизма в вакцине их подразделяют на:
Гомологичные вакцины - входит тот вид возбудителя, против которого создается иммунитет, например, против бешенства входит вакцинный штамм вируса бешенства.
Гетерологичные вакцины (дивергентные) - входит другой вид вируса имеющий общие антигены с вирусом, против которого создается иммунитет. Например, вакцина против болезни Марека готовится из вируса индеек, она защищает кур от болезни Марека.
В зависимости от количества типов или возбудителей, входящих в состав вакцины, различают:
Моновалентные вакцины - содержат антиген одного типа (вида) возбудителя.
Поливалентные (бивалентные, трехвалентные) вакцины - готовят из нескольких типов одного вида вируса. Например, трехвалентная противоящурная из культурального вируса ящура типов О-А-С.
Ассоциированные вакцины - содержат антигены разных видов возбудителей. Например, вакцина "Бивак" против инфекционного ринотрахеита и парагриппа - 3 крупного рогатого скота.
Смешанные вакцины являются разновидностью ассоциированных вакцин и представляют собой смесь вирусных и бактерийных антигенов. Например, вакцина портив чумы плотоядных , ботулизма и вирусного энтерита.
Инактивированные (убитые) вакцины
Инактивированные вакцины получают путем воздействия на микроорганизмы химическим путем или нагреванием. Такие вакцины являются достаточно стабильными и безопасными, так как не могут вызвать реверсию вирулентности. Они часто не требуют хранения на холоде, что удобно в практическом использовании. Однако у этих вакцин имеется и ряд недостатков, в частности, они стимулируют более слабый иммунный ответ и требуют применения нескольких доз (бустерные иммунизации).
Живые вакцины
Они содержат ослабленный живой микроорганизм. Примером могут служить вакцины против полиомиелита, кори, паротита, краснухи или туберкулеза. Могут быть получены путем селекции (БЦЖ, гриппозная). Они способны размножаться в организме и вызывать вакцинальный процесс, формируя невосприимчивость. Утрата вирулентности у таких штаммов закреплена генетически, однако у лиц с иммунодефицитами могут возникнуть серьезные проблемы. Как правило, живые вакцины являются корпускулярными.Примером живых вакцин могут служить вакцины для профилактики краснухи (Рудивакс), кори (Рувакс), полиомиелита (Полио Сэбин Веро), туберкулеза, паротита (Имовакс Орейон). Живые вакцины выпускаются в лиофилизированном виде (кроме полиомиелитной).
Ассоциированные вакцины
Вакцины различных типов, содержащие несколько компонентов (АКДС). Корпускулярные вакцины
Представляют собой бактерии или вирусы, инактивированные химическим (формалин, спирт, фенол) или физическим (тепло, ультрафиолетовое облучение) воздействием. Примерами корпускулярных вакцин являются: коклюшная (как компонент АКДС и Тетракок), антирабическая, лептоспирозная, гриппозные цельновирионные, вакцины против энцефалита, против гепатита А (Аваксим), инактивированная полиовакцина (Имовакс Полио, или как компонент вакцины Тетракок).
Химические вакцины
Химические вакцины — создаются из антигенных компонентов, извлеченных из микробной клетки. Выделяют те антигены, которые определяют иммуногенные характеристики микроорганизма. К таким вакцинам относятся: полисахаридные вакцины (Менинго А + С, Акт – ХИБ, Пневмо 23, Тифим Ви), ацеллюлярные коклюшные вакцины.
Биосинтетические вакцины
Биосинтетические вакцины — это вакцины, полученные методами генной инженерии, и представляют собой искусственно созданные антигенные детерминанты микроорганизмов. Примером может служить рекомбинантная вакцина против вирусного гепатита B, вакцина против ротавирусной инфекции. Для их получения используют дрожжевые клетки в культуре, в которые встраивают вырезанный ген, кодирующий выработку необходимого для получения вакцины протеин, который затем выделяется в чистом виде.
Векторные (рекомбинантные) вакцины
Вакцины, полученные методами генной инженерии. Суть метода: гены вирулентного микроорганизма, отвечающий за синтез протективных антигенов, встраивают в геном какого-либо безвредного микроорганизма, который при культивировании продуцирует и накапливает соответствующий антиген. Примером может служить рекомбинантная вакцина против вирусного гепатита B, вакцина против ротавирусной инфекции. Наконец, имеются положительные результаты использования т.н. векторных вакцин, когда на носитель — живой рекомбинантный вирус осповакцины (вектор) наносятся поверхностные белки двух вирусов: гликопротеин D вируса простого герпеса и гемагглютинин вируса гриппа А. Происходит неограниченная репликация вектора и развивается адекватный иммунный ответ против вирусной инфекции обоих типов.
Вакцины. Характеристика. Преимущества. Недостатки. Перспективы получения и использования.
Технологический процесс получения вакцин, состоит из следующих стадий.1) Подбор вакцинных штаммов. Для приготовления убитой вакцины отбирают несколько наиболее вирулентных и полноценных в антигенном отношении штаммов. Вирулентность - степень болезнетворного действия микроба. Ее можно рассматривать как способность микроба адаптироваться к организму хозяина, т.е. к новой среде, и преодолевать его защитные механизмы.
2) Получение маточной культуры (посевного материала). Посевным материалом служит 18-часовая агаровая культура в изотоническом растворе хлорида натрия (0,8%NaCl) с числом клеток 5-10 4 кл/мл, вводимая в объеме 5-10% к объему засеваемой среды, или 5-6-часовая бульонная культура.
3) Приготовление и стерилизация питательной среды. Брюшнотифозные бактерии выращивают на белково-гидролизатных или нолуеинтетических средах, позволяющих получать достаточно высокий выход биомассы, например бульон гидролизата казеина. 4) Выращивание микробной взвеси - ферментация. Выращивание проводят в асептических условиях методом глубинного культивирования в ферментерах. Режим культивирования периодический. В процессе культивирования подается стерильный воздух. Дополнительное перемешивание эарируемой среды обеспечивается турбинной или роторной мешалкой. Параметры культивирования: t=37°C, pH 7,6-7,8. Выращивание проводят 10-12 ч до концентрации бактерий порядка 4-6 -1010 кл/мл.5) Инактивация микробной взвеси. Для проведения инактивации полученную взвесь микробных клеток двукратно обрабатывают 96%-м этиловым спиртом в соотношении 1:4 и 1:10 соответственно. Обработку проводят при тщательном перемешивании в специальных емкостях. 6) Отделение клеток от кулътуралъной жидкости, как правило, проводят центрифугированием. 7) Титрование вакцины (стандартизация). Инактивированную биомассу ресуспенди-руют в зотоническом растворе хлорида натрия. Готовая вакцина должна содержать эпределенное количество микробных тел в 1 мл. Титр убитой брюшнотифозной вакцины составляет 5 • 109 кл/мл. К готовой вакцине прибавляют консервант, например, фенол (0,25%). 8) Контроль производится трем основным критериям: а) стерильность (отсутствие живых клеток генного микроба); б) безвредность (определение переносимости и токсичности); в) эффективность (способность препарата формировать антибактериальный иммунитет).
9) Розлив в ампулы;
10) Лиофилизация. суспензюо в ампулах замораживают при t= - 40 - 50 °С и лиофильно высущивают (в режиме возгонки воды).
11) Запайка ампул под вакуумом.
13 Основные требования, предъявляемые к вакцинным препаратам
Современные требования к вакцинным препаратам
Говоря о вакцинации в общем, следует отметить, что введение вакцинного препарата всегда сопряжено с определённым риском для здоровья человека. Этот риск значительно возрастает, если пациент страдает иммунодефицитным заболеванием. Поэтому, действуя во благо цивилизации, мы не должны пренебрегать интересами каждого конкретного человека.
Условия эффективной вакцинации таковы:
1. Вакцины должны индуцировать протективный иммунитет в очень высокой доле вакцинированных людей.
2. Для поддержания протективного иммунитета иногда необходимо производить бустерные (повторные) вакцинации.
3. Вакцины должны генерировать длительно сохраняющуюся иммунную память на соответствующий антиген.
4. Эффективные вакцины должны вести к генерации специфических антител и Т-клеток, направленных на корректные (значимые) эпитопы инфекционных агентов.5. Вакцины должны быть безопасными, т.е. не вызывать тяжёлых осложнений.Поэтому в настоящее время существуют определенные требования к вакцинам:
1. Вакцина должна быть иммуногенной, т.е. должна вызывать достаточно сильный иммунный ответ.
2. Вакцина должна быть безопасной, т.е. должна индуцировать протективный иммунитет с минимальными побочными эффектами для большинства лиц, получивших ее.
3. Вакцина должна индуцировать «правильный» (необходимый) тип иммунного ответа, т.е. вакцины должны стимулировать именно те механизмы иммунного ответа, которые эффективно защитят людей от конкретной инфекции с определённым механизмом передачи и локализацией первичного аффекта.
4. Вакцины должны быть стабильны в течение срока хранения. Живые аттенуированные вакцины для сохранения их стабильности требуют охлаждения на всем протяжении пути от завода-изготовителя до клиники. Многие инактивированные вакцины проще для хранения, особенно если они представлены в сухом виде и растворяются перед введением.
14. Вакцинопрофилактика – система мероприятий, осуществляемых в целях предупреждения, ограничения распространения и ликвидации инфекционных болезней путем проведения профилактических прививок.
Цели вакцинопрофилактики:
-Улучшение качества жизни человека
-Снижение смертности и инвалидизации от инфекционных болезней
-Предупреждение, ограничение распространения и ликвидация инфекционных болезней.
-Увеличение продолжительности жизни.
ВОЗ рассматривает стратегию по ликвидации в Европейском регионе эпидемического паротита, краснухи, ветряной оспы.
Прекращение иммунизации или недостаточный охват прививками населения ведет к развитию эпидемий.
Опыт вакцинопрофилактики свидетельствует, что при прекращении массовой иммунизации детей первых лет жизни или снижении охвата прививками ниже 95% происходит активизация длительно не регистрируемых или регистрируемых единично случаев управляемых инфекций.
Вакцинопрофилактика занимает значительное место в борьбе с инфекционными болезнями. Благодаря вакцинопрофилактике ликвидирована оспа, сведена к минимуму заболеваемость полиомиелитом, дифтерией, резко снижена заболеваемость корью, коклюшем, сибирской язвой, туляремией и другими инфекционными болезнями. Успехи вакцинопрофилактики зависят от качества вакцин и своевременного охвата прививками угрожаемых контингентов. Большие задачи стоят по совершенствованию В. против гриппа, бешенства, кишечных инфекций и других, а также по разработке В. против сифилиса, ВИЧ-инфекции, сапа и некоторых других. Современные иммунология и вакцинопрофилактика подвели теоретическую базу и наметили пути совершенствования В. в направлении создания очищенных поливалентных адъювантных синтетических В. и получения новых безвредных эффективных живых рекомбинантных вакцин.
Национальный календарь профилактических прививок – это схема обязательных прививок, осуществляемых в определенном возрасте детям и взрослым, которая позволяет наиболее полноценно защитить человека от инфекции. Он предусматривает проведение массовой иммунизации против основных инфекционных болезней: туберкулеза, полиомиелита, коклюша, дифтерии, столбняка, кори, краснухи, эпидемического паротита, вирусного  гепатита В, гриппа, гемофильной инфекции, пневмококковой инфекции и др.
С каждым годом устойчивость возбудителей инфекций к антибактериальным препаратам и другим лекарственным средствам увеличивается, в связи с чем лечение становится затруднительным. Многие инфекции, от которых проводится вакцинация, протекают молниеносно, приводят к летальным исходам или к инвалидности. По данным Всемирной организации здравоохранения, во всем мире ежегодно умирает более 12 миллионов детей, 2/3 этих смертей вызваны болезнями, которые могли бы быть предотвращены при помощи вакцин.
15. Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов
Именно бактерии стали первыми ГМО благодаря простоте организации их генома и манипуляций с клетками. Первый патент на генетически модифицированный штамм микроорганизмов, который был способен разлагать нефть, был выдан в США в 1980 г. всего через 8 лет после работы Берга по конструированию рекомбинантной ДНК. Еще через два года был разрешен для клинического использования синтезированный в бактерии E. coli первый лекарственный препарат - рекомбинантный человеческий инсулин.
Сейчас промышленная микробиология с использованием ГМ микроорганизмов развивается в основном по следующим направлениям: 1) производство продуктов биосинтеза трансгенных микроорганизмов, например, антибиотиков, гормонов, ферментов и витаминов; 2) использование биомассы микроорганизмов - производство медицинских вакцин, различных дрожжей, белково-витаминных концентратов и заквасок для получения кисломолочных продуктов и силосования кормов; 3) биотехнологии, основанные на уникальных способностях некоторых бактерий производить органические кислоты, этанол, углеводы и метан. Сюда же можно отнести и переработку некоторых отходов с возможностью получения полезных соединений, в первую очередь горючих газов (биотипливо). Использование трансгенных микроорганизмов в медицине. В настоящее время биотехнология на основе использования трансгенных микроорганизмов предлагает новые подходы к разработке и производству фармацевтических препаратов, а также позволяет выпускать в достаточных количествах широкий спектр лекарственных средств, которые раньше были малодоступны. Среди примерно 40-50 новых видов лекарств, вакцин и препаратов для диагностики, появляющихся на рынке ежегодно, 10-15 получены с помощью генно-инженерных методов, причем многие из них предназначены для лечения болезней, которые ранее считались неизлечимыми. К самому большому классу лекарств, получаемых путем микробного синтеза, относятся антибиотики. По разнообразию и показаниям к применению они занимают первое место среди продукции мировой фармацевтической промышленности. Сегодня известно более 6 000 видов антибиотиков, более 100 из которых находят применение в медицинской практике, в том числе при лечении таких тяжелых заболеваний, как туберкулез, менингит, плеврит, пневмония. Отдельные антибиотики, такие как блеомицин, применяют при лечении онкозаболеваний. Объем мирового рынка антибиотиков увеличивается в последнее время на 10-20 %/год и составляет более 23 млрд дол. Вторым классом лекарственных препаратов, производимых биотехнологическим путем в микроорганизмах, являются гормоны. В медицинских целях применяются два основных типа гормонов, различающихся по молекулярному строению: стероидные и пептидные. Среди стероидных гормонов можно выделить кортизон и преднизолон, которые широко используют при лечении различных аллергических заболеваний, в том числе такого тяжелого, как бронхиальная астма, а также ревматоидного артрита и других недугов. Другой обширной группой стероидов являются половые гормоны, такие как эстроген, широко применяемые для оральной контрацепции и лечения ряда заболеваний. Пептидные гормоны сейчас практически целиком производятся путем синтеза с помощью генетически модифицированных микроорганизмов. Сюда можно отнести уже упоминавшийся инсулин, а также такие антивирусные, антиопухолевые и иммуномодулирующие агенты, как интерфероны и интерлейкины.
Особое место среди лекарственных средств занимают ферменты, которые в широком диапазоне могут синтезировать ГМ-микроорганизмы. Ферменты используются - для лечения самых различных патологий: протеазы и липазы - для коррекции пищеварения; протеазы - для удаления некротических тканей, протеиназы с фибринолитическим действием - для растворения тромбов, а антикоагулянты, например плазмин, эффективны при лечении инфаркта миокарда и многие другие. Важный вклад микробной трансгенной биотехнологии в медицину состоит в получении профилактических препаратов, в первую очередь это производство вакцин против различных инфекций. Необходимый антиген можно получить с помощью непатогенного (аттенуированного) микроорганизма, инактивированного генно-инженерными методами, либо экспрессией рекомбинантного антигена и таким образом избежать опасностей, связанных с применением инактивированных вакцин. К числу важных практических достижений генной инженерии необходимо отнести и получение диагностических препаратов. Использование биомассы ГМ-микроорганизмов. Согласно прогнозам, к 2050 г. население Земли возрастет до 10 млрд чел. и для обеспечения его потребности в продукции сельского хозяйства нужно будет увеличить объем производства на 75 %. При этом человеку недостает в первую очередь белка животного происхождения, который по аминокислотному составу более богат, чем растительный белок. Промышленная микробиология поставляет животноводству, по крайней мере, три вида важных веществ: кормовой белок и белково-витаминные концентраты (БВК), незаменимые аминокислоты и кормовые антибиотики.
Добавление 1 т БВК в корма обеспечивает экономию 7 т фуражного зерна и дополнительное производство 0,8 т свинины или 5 т мяса птицы. Включение 1 т ГМ кормовых дрожжей в рацион телят и поросят позволяет экономить 6 т цельного молока. Эти ценные продукты получаются путем переработки ГМ-микроорганизмами подсолнечной лузги, кукурузных кочерыжек, соломы и других отходов сельского хозяйства, которые содержат клетчатку. Второй вид сельскохозяйственной биотехнологической продукции -незаменимые аминокислоты, производство которых для медицины и пищевой промышленности интенсивно развивается во всем мире. Среди них такие, как лизин и метионин, которые обязательно должны содержаться в готовом виде в пище человека и кормах животных. Метионин производят с помощью химической технологии, а лизин - в основном биотехнологически за счет ГМ-микроорганизмов. Добавление лизина в корм скоту резко увеличивает объем мясной продукции: на 1 т лизина высвобождается 40-50 т фуражного зерна и получается дополнительно более 10 т мяса. Помимо этого, в последнее время в животноводстве и растениеводстве используется около 100 биопрепаратов, таких как стимуляторы роста животных и растений, энтомопатогены и ГМ бактериальные удобрения. Применение таких средств позволяет отказаться от использования или снизить в разы количество применяемых химических средств защиты и минеральных удобрений, что приводит к повышению качества продукции и созданию экологически чистых технологий. Использование ферментов и добавок в пищевой и кормовой промышленности, произведенных с помощью ГМ-микроорганизмов, означает, что ГМ-микроорганизмы инактивированы, разрушены или удалены из конечного продукта. Генетически модифицированные дрожжи, грибки и бактерии используют для этих целей уже более десятилетия. В качестве примеров можно привести используемую в хлебопечении альфа-амилазу, применяемую при производстве фруктозы глюкозоамилазу и необходимый для ферментации сыра фермент химозин. Большинство используемых в пищевой промышленности трансгенных микроорганизмов являются производными микроорганизмов, применяемых в традиционной пищевой биотехнологии. В ряде стран трансгенные микроорганизмы разрешены также для производства микронутриентов, таких как витамины и аминокислоты, используемых в качестве продуктов питания или добавок к рациону. Примером является производство каротиноидов (используемых в качестве пищевых добавок, красителей и добавок к рациону) в ГМ бактериальных системах. В будущем в ГМ-микроорганизмы можно будет интегрировать целые метаболические пути, что позволит синтезировать совершенно новые соединения. Для нужд животноводства с помощью генной инженерии разработаны такие ветеринарные продукты, как бычий соматотропин, применяемый для повышения эффективности производства молока. В некоторых странах бычий соматотропин впервые появился на рынке более 10 лет назад. Микроорганизмы в качестве продуктов питания. В настоящее время на рынке нет коммерческих продуктов, содержащих живые генетически модифицированные микроорганизмы. В 1993 г. в Великобритании ГМ-дрожжи получили официальное одобрение для использования в пивоваренной промышленности, однако попытки коммерциализовать продукт не предпринимались. К другим микроорганизмам, использующимся для производства продуктов питания (находящимся на стадии исследований и разработки), относятся сбраживающие культуры для хлебопечения и пивоварения и молочнокислые бактерии, применяемые при производстве сыра. Целью исследований и разработки также является минимизация инфицирования патогенными микроорганизмами и повышение питательной ценности и вкусовых качеств конечного продукта. Предпринимаются также попытки генетически модифицировать микроорганизмы пищеварительного тракта крупного рогатого скота с целью защиты животных от отравляющих компонентов корма. Современные методы биотехнологии используют также для создания пробиотиков - микроорганизмов, употребление определенного количества которых с пищей оказывает положительное влияние на здоровье. Биоремедиация. Известно, что основной вред окружающей среде наносят стоки химических предприятий, содержащие различные синтетические органические соединения, разложение которых в природе происходит крайне медленно. Многие из таких отходов являются ксенобиотиками - токсичными веществами, не включающимися в метаболизм живых организмов. Микробиологи изучают пути катоболизма ксенобиотиков, возможности их разложения и детоксикации. Среди огромного разнообразия бактерий можно найти отдельные организмы, использующие самые уникальные варианты путей метаболизма, включающие необычные химические соединения. Опираясь на глубокие знания физиологии бактерий, ученые создают ГМ-микроорганизмы с такой комбинацией метаболических путей, что становится возможна переработка или разложение самых необычных, в том числе токсичных, соединений. На основе этих исследований создают биотехнологические способы очистки воды от неприродных соединений, а также методы, позволяющие контролировать загрязнения окружающей среды. В настоящее время ежегодный объем продаж таких препаратов для контроля и мониторинга загрязнений составляет около 10 млн дол., а в ближайшей перспективе эта цифра может достичь 200 млн дол. Еще одна беда, стоящая перед человечеством, - загрязнение земель и водоемов нефтью и нефтепродуктами. Подобные загрязнения занимают огромные площади вокруг мест добычи нефти, нефтеперерабатывающих предприятий и портов. Нередко причинами экологических бедствий становятся аварии на судах, особенно танкерах, когда нефтью загрязняются акватории и берега рек и морей. Методы генной инженерии активно используются для разработки штаммов-деструкторов, способных быстро разлагать массивные скопления нефтепродуктов. 
16. Вектор в генетической инженерии. Классификация. Характеристика. Требования, предъявляемые к ним.
Генетические векторы Под понятием "вектор" понимается молекула нуклеиновой кислоты, способная после введения в клетку к автономному существованию за счет сигналов репликации и транскрипции. Векторные молекулы обладают свойствами:
1) способностью автономно реплицироваться в клетке-реципиенте, то есть быть самостоятельным репликоном;
2) содержать один или несколько маркерных генов, благодаря экспрессии которых у клетки-реципиента появляются новые признаки, позволяющие отличить трансформированные клетки от исходных;
3) содержать по одному или по два участка (сайта) для различных рестриктаз в разных районах (в составе маркерных генов), но не в области, ответственной за их репликацию.
Классификация. Характеристика
В зависимости от целей эксперимента векторы можно разделить на две группы:
1) используемые для клонирования и амплификации нужного гена;
2) специализированные, применяемые для экспрессии встроенных чужеродных генов. Вторая группа векторов объединяет векторы, призванные обеспечить синтез белковых продуктов клонированных генов. Векторы для экспрессии содержат последовательности ДНК, необходимые для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в штаммах клеток. В качестве прокариотических векторов используются плазмиды, бактериофаги; в качестве эукариотических векторов применяют вирусы животных и растений, векторы на основе 2 мкм дрожжей и митохондрий и ряд искусственных векторов, способных реплицироваться как в бактериальных, так и в эукариотических клетках (челночные векторы). Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетках. Большинство плазмидных векторов получено на основе природных плазмид ColE1, pMB1 и p15A.
Бактериальные плазмиды делят на два класса. Одни плазмиды (изученный фактор F, определяющий пол у E.coli) сами способны переходить из клетки в клетку, другие такой способностью не обладают. По ряду причин, и прежде всего для предотвращения неконтролируемого распространения потенциально опасного генетического материала, подавляющее большинство бактериальных плазмидных векторов создано на базе плазмид второго класса. Многие природные плазмиды уже содержат гены, определяющие устойчивость клеток к антибиотикам (ферменты, модифицирующие или расщепляющие антибиотические вещества). Кроме того, в эти плазмиды при конструировании векторов вводятся дополнительные гены, определяющие устойчивость к другим антибиотикам. На рис. 1 показан один из самых распространенных плазмидных векторов E.coli - pBR322. Он сконструирован на базе детально изученной плазмиды E.coli - колициногенного фактора ColE1 - и содержит ориджин репликации этой плазмиды. Особенность плазмиды ColE1 (и pBR322 соответственно) состоит в том, что в присутствии ингибитора синтеза белка антибиотика хлорамфеникола (опосредованно ингибирующего репликацию хозяйской хромосомы) ее число в E.coli возрастает от 20-50 до 1000 молекул на клетку, что позволяет получать большие количества клонируемого гена. При конструировании вектора pBR322 из исходных плазмид был делегирован целый ряд "лишних" сайтов для рестриктаз
Детальная рестрикционная карта плазмиды pBR322.В настоящее время наряду с множеством удобных векторных систем для E.coli сконструированы плазмидные векторы для ряда других бактерий (в т.ч. Pseudomonas, Rhizobium и Azotobacter), грамположительных бактерий (Bacillus), низших грибов (дрожжи) и растений. Плазмидные векторы удобны для клонирования относительно небольших фрагментов (до 10 тыс. пар оснований) геномов небольших размеров. Если же требуется получить клонотеку (или библиотеку) генов высших растений и животных, общая длина генома которых достигает огромных размеров, то обычные плазмидные векторы для этих целей непригодны. Проблему создания библиотек генов для высших эукариот удалось решить с использованием в качестве клонирующих векторов производных бактериофага. Среди фаговых векторов наиболее удобные системы были созданы на базе геномов бактериофагов l и М13 E.coli. ДНК этих фагов содержит протяженные области, которые можно делегировать или заменить на чужеродную ДНК, не затрагивая их способности реплицироваться в клетках E.coli. При конструировании семейства векторов на базе ДНК l фага из нее сначала (путем делений коротких участков ДНК) были удалены многие сайты рестрикции из области, не существенной для репликации ДНК, и оставлены такие сайты в области, предназначенной для встраивания чужеродной ДНК. В эту же область часто встраивают маркерные гены, позволяющие отличить рекомбинантную ДНК от исходного вектора.
Такие векторы широко используются для получения "библиотек генов". Размеры замещаемого фрагмента фаговой ДНК и соответственно встраиваемого участка чужеродной ДНК ограничены 15-17 тыс. нуклеотидных остатков, так как рекомбинантный фагоый геном, который на 10% больше или на 75% меньше генома дикого l фага, уже не может быть упакован в фаговые частицы. Таких ограничений теоретически не существует для векторов, сконструированных на базе нитчатого бактериофага М13. Описаны случаи, когда в геном этого фага была встроена чужеродная ДНК длиной около 40 тыс. нуклеотидных остатков. Известно, однако, что фаг М13 становится нестабильным, когда длина чужеродной ДНК превышает 5 тыс. нуклеотидных остатков. Фактически векторы, полученные из ДНК фага М13, используются главным образом для секвенирования и мутагенеза генов, и размеры встраиваемых в них фрагментов намного меньше. Эти векторы конструируются из реплекативной (двутяжевой) формы ДНК фага М13, в которую встроены "полилинкерные" участки.
Требования, предъявляемые к ним.
Важным моментом при конструировании ДНК-вакцин является проблема целенаправленной доставки генов в необходимые клетки и защиты вводимых ДНК от действия нуклеаз крови. В результате экспериментальной работы были созданы разнообразные конструкции, позволяющие доставлять целевые гены в клетки-мишени. Одной из подобных конструкций является модель молекулярного вектора для доставки генов в такие клетки, как лимфоциты и кераноциты. В качестве модельного был использован ген, кодирующий гибридный белок: фактор некроза опухолей-альфа - интерферон-гамма. В центре вектора находится интактная плазмидная ДНК, содержащая доставляемый ген, а на поверхности располагаются антитела к клеткам-мишеням. Конъюгат полиглюкина со спермидином и антителами применяется для связи компонентов (положительно заряженный спермидин обеспечивает связывание конъюгата с плазмидной ДНК). Описанный молекулярный вектор позволяет целенаправленно доставлять гены в клетки-мишени, сводя до минимума их попадание в другие виды клеток, защищать доставляемые гены от нуклеаз крови и использовать положительно заряженный комплекс спермидин-полиглюкин в качестве стимулятора проникновения ДНК в клетки. В настоящее время также создана векторная модель для доставки в клетки костного мозга гена, кодирующего гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (чГ-КСФ).

17. Создание с помощью методов генетической инженерии высокоактивных продуцентов лекарственных веществ
Возникновение и формирование генной инженерии как науки в середине 70-х гг. XX века послужило значительным импульсом для развития биотехнологического производства биологически активных веществ (БАВ), в том числе и белковых препаратов медицинского назначения. Возможность конструирования организмов с заданными свойствами существенно видоизменила структуру и содержание современного биотехнологического производства БАВ:
1) значительно повысилась продуктивность производственных штаммов микроорганизмов – продуцентов целевых продуктов за счет усовершенствования метаболического пути их биосинтеза (введение дополнительных генов, увеличение их количества или активности и т.п.);
2) за счет введения чужеродных генов в микробную клетку удалось получить продуценты, синтезирующие изначально несвойственные им соединения, в том числе белки человека (интерфероны, интерлейкины, гормон роста, инсулин и др.) и ферменты (протеазы, липазы, протеиназы и др.), что способствовало значительному расширению ассортимента и разнообразия биотехнологической продукции.
В настоящее время с помощью методов генной инженерии, в том числе и посредством биотехнологии рекомбинантных ДНК (рДНК), клонировано более 500 генов различных белков человека, которые уже являются или могут в скором времени стать ЛС. По подсчетам специалистов ВОЗ, ежегодный объем мирового рынка лекарственных препаратов (ЛП) на основе белков человека составляет порядка 200 млрд долларов, что в целом соответствует 17% общемирового фармацевтического рынка. Следует отметить, что рынок препаратов рекомбинантных белков неуклонно развивается и растет, достигая порядка 19% в год. При этом доля России в производстве данных ЛС составляет всего 0,6%. По результатам экспертной оценки к 2020 г. в нашей стране планируется вывести на рынок около 200 инновационных препаратов отечественной разработки, производимых на территории РФ. К ним прежде всего относятся: инсулин (29%), эритропоэтин (12%), гормон роста (5%), α-интерферон (21%), β-интерферон (11%), факторы свертывания крови (6%) и дрНаглядным примером успехов реализации технологий рДНК в биотехнологии служит производство интерферонов. В настоящее время можно получить любое необходимое количество интерферона для целей клинической практики. Так, с помощью методов биотехнологии можно из 1 л культуры ткани получить порядка 108 ед. интерферона, в то время как 1 л культуры E. coli позволяет получить 1010 ед. рекомбинантного интерферона [2, 10].
В качестве еще одного примера успешного практического применения рекомбинантных продуцентов следует отметить биотехнологическое производство инсулина. Так, для получения 100 г кристаллического инсулина требуется около 800–1000 кг поджелудочной железы крупного рогатого скота, при этом одна железа коровы весит порядка 200–250 г. В этой связи инсулин в течение долгого времени оставался очень дорогостоящим и труднодоступным препаратом для широкого круга больных сахарным диабетом. Только в 1978 г. исследователи компании «Genentech, Inc.» впервые получили инсулин с помощью специально сконструированного штамма E. coli [2].
Кроме того, в настоящее время ряд фирм организует производство интерферона с использованием рекомбинантных дрожжей. К преимуществам данного продуцента интерферона в сравнении с E. coli относятся: наличие секреторных систем, благодаря которым можно получить внутриклеточный интерферон, а также отсутствие токсичных веществ, свойственных бактериальному продуценту.
наиболее распространенным продуцентам белковых препаратов относятся рекомбинантные микроорганизмы, в том числе [1, 9, 20, 21]:
E. coli;
Bacillus spp.;Erwinia spp.;Pseudomonas spp.;Rhizobium spp.;Saccharomyces cerevisiae;
Pichia pastoris и др.При выборе микроорганизма в качестве продуцента чужеродного белка необходимо знать структуру его генома и метаболизм на уровне вида [1, 9]. Помимо этого, для того чтобы микроорганизмы можно было использовать как генетически модифицированные продуценты ЛС, в том числе и белковых препаратов, они должны удовлетворять целому ряду предъявляемых к ним обязательных требований [1, 2, 9, 22]:
1)    отсутствие у микроорганизма-реципиента патогенных и токсикогенных свойств;
2)    безопасность генно-инженерных производных;
3)    высокая скорость размножения штамма продуцента целевого продукта;
4)    способность штаммов продуцентов целевого продукта к росту и развитию на простых, доступных и экономичных питательных средах;
18. Стволовые клетки, выделение и культивирование. Область и перспективы применения
Стволовы́е кле́тки — недифференцированные (незрелые) клетки, имеющиеся у многих видов многоклеточных организмов. Стволовые клетки способны самообновляться, образуя новые стволовые клетки, делиться посредством митоза и дифференцироваться в специализированные клетки, то есть превращаться в клетки различных органов и тканей.
Стволовые клетки можно разделить на три основные группы в зависимости от источника их получения: эмбриональные, фетальные и постнатальные (стволовые клетки взрослого организма).
Эмбриональные стволовые клетки
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) образуют внутреннюю клеточную массу (ВКМ), или эмбриобласт, на ранней стадии развития эмбриона. Они являются плюрипотентными. Важный плюс ЭСК состоит в том, что они не экспрессируют HLA (human leucocyte antigens), то есть не вырабатывают антигены тканевой совместимости. Каждый человек обладает уникальным набором этих антигенов, и их несовпадение у донора и реципиента является важнейшей причиной несовместимости при трансплантации. Соответственно, шанс того, что донорские эмбриональные клетки будут отторгнуты организмом реципиента очень невысок. При пересадке иммунодефицитным животным эмбриональные стволовые клетки способны образовывать опухоли сложного (многотканевого) строения — тератомы, некоторые из них могут стать злокачественными. Достоверных данных, о том как ведут себя эти клетки в иммунокомпетентном организме, например, в организме человека, нет. Вместе с тем, следует отметить, что клинические испытания с применением дифференцированных дериватов (производных клеток) ЭСК уже начаты.
Одним из главных недостатков ЭСК является невозможность использования аутогенного, то есть собственного материала, при трансплантации, поскольку выделение ЭСК из эмбриона несовместимо с его дальнейшим развитием.
Фетальные стволовые клетки
Фетальные стволовые клетки получают из плодного материала после аборта (обычно срок гестации, то есть внутриутробного развития плода, составляет 9—12 недель). Естественно, изучение и использование такого биоматериала также порождает этические проблемы. В некоторых странах, например, на Украине и в Великобритании, продолжаются работы по их изучению и клиническому применению. К примеру, британская компания ReNeuron исследует возможности использования фетальных стволовых клеток для терапии инсульта. Эти клетки уже начали дифференцировку, и, следовательно, каждая из них, во-первых, может пройти только ограниченное число делений, и, во-вторых, дать начало не любым, а достаточно определенным видам специализированных клеток. Так, из клеток фетальной печени могут развиться специализированные клетки печени и кроветворные клетки. Из фетальной нервной ткани, соответственно, развиваются более специализированные нервные клетки.
Постнатальные стволовые клетки
Несмотря на то, что стволовые клетки зрелого организма обладают меньшей потентностью в сравнении с эмбриональными и фетальными стволовыми клетками, то есть могут порождать меньшее количество различных типов клеток, этический аспект их исследования и применения не вызывает серьёзной полемики. Кроме того, возможность использования аутогенного материала обеспечивает эффективность и безопасность лечения. Стволовые клетки взрослого организма можно подразделить на три основных группы: гемопоэтические (кроветворные), мультипотентные мезенхимальные (стромальные) и тканеспецифичные прогениторные клетки.
Иногда в отдельную группу выделяют клетки пуповинной крови, поскольку они являются наименее дифференцированными из всех клеток зрелого организма[источник не указан 1439 дней], то есть обладают наибольшей потентностью. Пуповинная кровь в основном содержит гемопоэтические стволовые клетки, а также мультипотентные мезенхимальные, но в ней присутствуют малые количества других разновидностей стволовых клеток, при определённых условиях способные дифференцироваться в клетки различных органов и тканей.
Гемопоэтические стволовые клетки
Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) — мультипотентные стволовые клетки, дающие начало всем клеткам крови миелоидного (моноциты, макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты и тромбоциты, дендритные клетки) и лимфоидного рядов (Т-лимфоциты, В-лимфоциты и естественные киллеры). Определение гемопоэтических клеток было основательно пересмотрено в течение последних 20 лет. Гемопоэтическая ткань содержит клетки с долгосрочными и краткосрочными возможностями к регенерации, включая мультипотентные, олигопотентные и клетки-предшественники. Миелоидная ткань содержит одну ГСК на 10 000 клеток. ГСК являются неоднородной популяцией. Различают три субпопуляции ГСК, в соответствии с пропорциональным отношением лимфоидного потомства к миелоидному (Л/M). У миелоидно ориентированных ГСК низкое Л/М соотношение (>0, <3), у лимфоидно ориентированных — высокое (>10). Третья группа состоит из «сбалансированных» ГСК, для которых 3 ≤ Л/M ≤ 10. В настоящее время активно исследуются свойства различных групп ГСК, однако промежуточные результаты показывают, что только миелоидно ориентированные и «сбалансированные» ГСК способны к продолжительному самовоспроизведению. Кроме того, эксперименты по трансплантации показали, что каждая группа ГСК преимущественно воссоздаёт свой тип клеток крови, что позволяет предположить наличие наследуемой эпигенетической программы для каждой субпопуляции.
Область и перспективы применения
Для лечения анемии в 1988 году во Франции были впервые применены стволовые клетки
Высокоэффективное лечение стволовыми клетками опухолей, инсультов, инфарктов, травм, ожогов, заставило создавать в развитых странах специальные учреждения (банки) для хранения замороженных стволовых клеток в течение долгого времени.
В такой коммерческий именной банк крови уже сегодня возможно, по заказу родственников, поместить пуповинную кровь ребенка, с тем, чтобы в случае его травмы, болезни, была возможность использовать собственные стволовые клетки.
Пересадка внутренних органов восстанавливает здоровье человека только в том случае, если она проведена своевременно, и не произошло отторжение органа иммунной системой пациента.
Примерно 75 % пациентов, нуждающихся в пересадке органов, погибает в период ожидания. Стволовые клетки могут стать идеальным источником «запасных частей» для человека.
Уже сегодня – спектр применения стволовых клеток в лечении самых тяжелых заболеваний очень широк.
Восстановление нервных клеток позволяет восстановить капиллярное кровообращение и вызвать рост капиллярной сети на месте поражения. Для лечения повреждённого спинного мозга используют введение нервных стволовых клеток, либо чистые культуры, которые затем превратятся на месте в нервные клетки.
Некоторые формы лейкозов у детей стали излечимы благодаря достижениям биомедицины. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток применяется в современной гематологии, а трансплантация стволовых клеток костного мозга – в широкой клинике.
Исключительно сложны в лечении системные заболевания, вызванные нарушением функций иммунной системы: артриты, рассеянный склероз, красная волчанка, болезнь Крона. Гемопоэтические стволовые клетки применимы и при лечении этих заболеваниях
Имеется практический клинический опыт в применении нейральных стволовых клеток при лечении болезни Паркинсона. Результаты превосходят всякие ожидания.
Мезинхимальные (стромальные) стволовые клетки уже используют в ортопедической клинике несколько последних лет. С их помощью восстанавливают разрушенные суставные хрящи, костные дефекты после переломов.
Кроме того, эти же клетки в последние два-три года используют методом прямого введения в клинике восстановления сердечной мышцы после инфаркта.
С каждым днем пополняется список болезней, которые поддаются лечению стволовыми клетками. И это даёт надежду на жизнь неизлечимым больным.
Список заболеваний, при лечении которых используются стволовые клетки
Доброкачественные заболевания:
адренолейкодистрофия;
анемия Фанкони;
остеопороз;
болезнь Гюнтера;
синдром Харлера;
талассемия;
идиопатическая апластическая анемия;
рассеянный склероз;
синдром Леш-Нихана;
амегакариоцитозная тромбоцитопения;
синдром Костмана;
волчанка;
резистентный ювенильный артрит;
иммунодефицитные состояния;
болезнь Крона;
синдром Бара;
коллагенозы.
Злокачественные заболевания:
неходжкинская лимфома;
миелодиспластический синдром;
лейкемия;
рак молочных желёз;
нейробластома.
19. Методы исследования, позволяющие определять генетически модифицированные объекты в кормах и продуктах питания
В системе лабораторного контроля трансгенных продуктов можно выделить два направления. Это методы ДНК-диагностики и методы обнаружения трансгенных белков на основе иммунодиагностики. На основе ДНК-диагностики (ПЦР, ГЕЦР в режиме «реального времени») определяют как конкретные встроенные гены, так и регуляторные участки ДНК векторных конструкций (35 S - промотор, NOS - терминатор). Иммунологические методы позволяют определять непосредственно трансгенные белки. Они основаны на образовании устойчивого комплекса молекулы трансгенного белка (антигена) со специфичными к нему антителами.
20. Потенциальные экологические риски распространения ГМО. Методы контроля
Все потенциальные нежелательные явления и события, происходящие при возделывании и потреблении ГМО растительного происхождения, можно подразделить на три группы потенциальных рисков: экологические, агротехнические и пищевые [9, 10]. Как показано многочисленными отечественными и зарубежными научными исследователями, существование наиболее обсуждаемых в средствах массовой информации пищевых рисков обусловлено, прежде всего, действием белков – продуктов биологической активности трансгенов ГМО. Однако пищевые риски – это хотя и важное, но всего лишь заключительное звено в цепочке потенциальных рисков, определяемых ГМО, поскольку потенциальные пищевые риски являются закономерным следствием распространения и реализации экологических и агротехнических рисков. 
Первым и наиболее опасным звеном являются экологические риски. Потенциальные экологические риски ГМО обуславливают ту опасность, которая вытекает из законов генетической и экологической изменчивости живых организмов, поскольку затрагивает ДНК, т.е. непосредственно саму систему наследственного аппарата живых организмов, вызывая изменения на генетическом уровне (появление мутаций), которые передаются потомкам в последующих поколениях. Исходя из этого, можно заключить, что потенциальные экологические риски заключают в себе опасность глобального нарушения эколого-генетического равновесия естественных и антропогенных систем, причем необратимого характера.
На сегодня полностью не ясны и потенциальные агротехнические риски распространения ГМО для живой природы и человека. Прежде всего, это угроза естественному биоразнообразию, включая разнообразие эндемичных организмов. Кроме того, распространение ГМО в природе может привести к сокращению видового разнообразия живых организмов, обитающих на полях, где они выращиваются, и вокруг них. В результате неконтролируемого распространения ГМ-растений может происходить ухудшение их свойств и потеря генетической чистоты традиционных сортов. Это, в свою очередь, может привести к образованию так называемой “скрытой” формы ГМО, которая будет попадать в корма животных и на стол человека случайным образом, без ведома последнего, приводя в итоге к реализации вышеперечисленных пищевых рисков [6, 9].В связи с этим для оценки экологической, агротехнической и пищевой безопасности ГМ-культур необходимо знать механизмы их распространения в окружающей среде еще до того, как растения со встроенными генами, либо с новыми комбинациями кодирующих белковых полипептидов в их составе, начнут выращивать на открытых полях. Если традиционное растениеводство базируется на унаследованном многовековом опыте безопасного применения селекционных достижений, то современной биотехнологии, основанной на использовании генной инженерии, не хватает подобных поддерживающих гарантий. При производстве и использовании генно-инженерно-модифицированных организмов следует учитывать, что ДНК-технологии предполагают активное вмешательство человека в генетические механизмы эволюционного развития, последствия которого для будущих поколений остаются неясными.
 Наиболее эффективным методом контроля на сегодняшний день является метод ПЦР, позволяющий не только выявить наличие ГМО в продуктах, но и определять их количество.
21. Метод гибридизации ДНК. Принцип метода гибридизации ДНК. Методика постановки и область практического применения
Гибридизация ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот — соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. При полной комплементарности объединение происходит легко и быстро, а в случае частичной некомплементарности слияние цепочек замедляется, что позволяет оценить степень комплементарности. Возможна гибридизация ДНК-ДНК и ДНК-РНК.
Принцип метода. Метод основан на специфическом взаимодействии (гибридизации) двух образцов ДНК: меченого ДНК-зонда и участка плазмидной или хромосомной ДНК (Г. Бантинг и др., 1990). Образовавшиеся двухцепочечные ДНК отделяют от одноцепочечных и определяют присутствие метки. В качестве контроля используют ДНК известного штамма микроорганизма. Степень реассоциации таких гомологичных одноцепочечных ДНК принимают условно за 100 %. При 60…100 % гомологии ДНК можно говорить о принадлежности сравниваемых бактерий к одному виду.
Доводы в пользу гибридизации:
с помощью зондов (зонд — определенный фрагмент ДНК, содержащего известный ген — генетический маркер) можно обнаружить микроорганизмы, которые трудно культивируются in vitro;
зонды позволяют отличить вирулентные штаммы от авирулентных in vitro;
быстрая идентификация микроорганизма непосредственно в биологическом материале от больных животных, пробах из окружающей среды и в фиксированных спиртом или формалином образцах после хранения;
нет необходимости направлять образцы для идентификации в специализированные лаборатории и институты;
высокая достоверность выявления единичных микробных клеток.
22. Химеры. Естественные химеры и искусственно созданные.
Химера — организм, состоящий из генетически разнородных клеток. У животных химерами называют организмы, клетки которых происходят от двух и более зигот. Химеризм у животных нужно отличать от мозаицизма — присутствия в одном организме генетически разнородных клеток, происходящих от одной зиготы. Часто химерически построенными являются не целые организмы, а лишь их отдельные органы или части.
Естественные химеры почти никогда не обнаруживаются, если они не показывают отклонения, такие как мужчина/женщина или особенности гермафродита или неравная пигментация кожи. Самыми значимыми являются некоторые черепаховые кошки мужского пола или животные с неоднозначными сексуальными органами.
В биологическом исследовании химеры искусственно произведены, выборочно пересадив эмбриональные клетки от одного организма на эмбрион другого и позволив проистекающей бластоцисте развиться. Химеры не гибриды, которые формируются из сплава гамет от двух разновидностей, которые формируют единственную зиготу с объединенной организацией генетического материала или Гибридомы, которые, как с гибридами, следуют из сплава камер двух разновидностей в единственную клетку и искусственное распространение этой клетки в лаборатории. По существу, в химере, каждая клетка от любой из родительских разновидностей, тогда как в гибриде и гибридоме, каждая клетка получена из обеих родительских разновидностей. «Химера» - широкий термин и часто применяется ко многим различным механизмам смешивания клеток от двух различных разновидностей.
Как с клонированием, процесс создания и внедрения химеры неточен с большинством эмбрионов, спонтанно заканчивающихся. Успехи, однако, привели к основным продвижениям в области эмбриологии, поскольку создание химер одной разновидности с различными физическими чертами, такими как цвет, позволило исследователям прослеживать дифференцирование эмбриональных клеток посредством формирования систем органа во взрослом человеке.
23. Понятие химера. История развития метода, примеры успешного применения метода для получения конкретных результатов в растениеводстве и животноводстве.
Химера — организм, состоящий из генетически разнородных клеток. У животных химерами называют организмы, клетки которых происходят от двух и более зигот. Химеризм у животных нужно отличать от мозаицизма — присутствия в одном организме генетически разнородных клеток, происходящих от одной зиготы.
История метода
Предположение о том, что соматические клетки могут сливаться друг с другом, было высказано еще в начале ХIX века в связи с открытие многоядерных клеток. В историческом аспекте представляет интерес то обстоятельство, что открытие поликарионов как бы подтверждало ошибочное представление Шлейдена, который считал, что новые клетки зарождаются в виде пузырьков внутри цитоплазматической мембраны родительских клеток. Разделявший эту точку зрения Рудольф Вирхов представил в 1851 г. рисунок многоядерной опухолевой клетки в полной уверенности, что ядра являются эндогенными зачатками новых клеток. Кроме того, открытие поликарионов подлило масла в огонь борьбы с клеточной теорией. Противники ее выдвинули гипотезу, согласно которой организм представляет собой единую тканевую массу с непрерывной цитоплазмой, а существование поликарионов рассматривали как подтверждение этой гипотезы. Со временем восторжествовала клеточная теория, а существование поликарионов отнесли к разряду интересных исключений.
Гибриды соматических клеток были открыты лишь в 60-х годах нашего столетия. В 1960 г. Барский с сотрудниками сообщили о выделении линии гибридных клеток. Гибридные клетки были получены путем смешения двух линий, выделенных ранее из 1 клетки мышиной саркомы. Исходные линии отличались по числу и морфологии хромосом, а также по способности к образованию опухоли при введении их мышам. Гибридные клетки содержали число хромосом, отличное от исходных клеточных линий, а также содержали поверхностные антигены клеток обеих родительских линий. Далее было установлено, что клеточные гибриды можно получить, используя клетки различных видов животных. В качестве агента, индуцирующего слияние выступал инактивированный вирус HVJ, называемый также вирусом Сендай. С этих пор вирус Сендай стал широко использоваться в экспериментах по слиянию клеток.
При изучении межвидовых гибридных клеток, способных к пролиферации были сделаны два очень важных наблюдения:
- в гибридах могут проявиться оба генома;
- в долгоживущих межвидовых гибридах элиминируются хромосомы одного вида.
Слияние клеток не обязательно должно быть чем-то стимулировано. Как in vivo, так и in vitro оно может проходить и без добавления специальных агентов. Несмотря на то, что все слияния такого рода можно считать спонтанными, некоторые из них постоянно происходят в процессе онтогенеза, а следовательно, эволюционно запрограммированы. До сих пор нерешенной остается одна из труднейших загадок биологии, состоящая в том, что мембраны, находящиеся внутри клетки сливаются часто, тогда как мембраны, разграничивающие клетки, сливаются редко. Например, пузырьки аппарата Гольджи сливаются друг с другом, образуя клеточные пластинки при цитокинезе у растений, мембраны эндоплазматического ретикулума - с элементами аппарата Гольджи при переносе вновь синтезированных белков и т.д.
В то же время нормальные клетки в естественных условиях крайне редко сливаются друг с другом. Исключение составляет процесс оплодотворения. Кроме того, в качестве подобного рода исключения выступает процесс плазмогамии у высших грибов, когда одноядерные гаплоидные клетки сливаются, образуя двуядерные (дикарионы). Такие клетки размножаются митотически, оставаясь двуядерными, и в результате образуют всем хорошо известные плодовые тела.
В естественных условиях слияние клеток происходит и у млекопитающих. Например, клетки могут сливаться при формировании мышечных трубочек. Еще в XIX веке было показано, что миофибриллы поперечно-полосатых мышц образуются в поликарионах - крупных удлиненных многоядерных клетках. Поликарионы - продукт слияния одноядерных миобластов. Слияние опухолевых клеток - довольно обычное явление, при этом опухолевые клетки in vivo иногда сливаются и с нормальными. Эксперименты по спонтанному слиянию клеток проводились и in vitro. При проведении подобных экспериментов получают так называемых "химерных" или аллофеных мышей - животных, в тканях которых содержатся клетки различных генотипов.
В 2007 году учеными из Университета Невады создали химерную овцу, кровь которой содержало 15% человеческих и 85% овечих клеток
В 2017-м году учеными из Salk Institute был создан эмбрион химеры - свиньи с клетками человека
24. Селекция культур и внедрение ГМ сортов в практику продовольственной промышленности.
Традиционная селекция, в особенности сельскохозяйственных растений, домашнего скота и птицы, направлена на увеличение продуктивности сельского хозяйства, повышение устойчивости зрения питательности и легкости обработки. Достижения в области разработки методов генетики и клеточной биологии 1960-х годов внесли свой вклад в так называемую «зеленую революцию», которая значительно увеличила количество выращиваемых в некоторых развитых и развивающихся странах сортов пищевых культур массового производства, обладающих признаками, обеспечивающими получение высоких урожаев и устойчивость к заболеваниям и вредителям (Borlaug, 2000). Основным движущим фактором зеленой революции была идея обеспечения достаточного количества продуктов питания для всего населения планеты. Однако интенсификация и расширение сельского хозяйства, вызванные внедрением новых методов и сельскохозяйственных систем, привели к появлению новых рисков для здоровья и окружающей среды – например, увеличению количества распыляемых агрохимикатов и усилению эрозии почвы в результате интенсификации обработки почвы.
Развитие молекулярной биологии в 1970-х и 1980-х годах привело к появлению более простых методов анализа генетических последовательностей, позволяющих идентифицировать генетические маркеры желаемых признаков. Отбор, проводимый по таким маркерам, является основой некоторых современных стратегий традиционной селекции.
Несмотря на то, что современные методы селекции в течение последних 50 лет значительно повысили урожайность, потенциал их применения в будущем значительно ограничен небольшим природным разнообразием генотипов внутри одной культуры и невозможностью межвидового скрещивания.
С целью преодоления этих барьеров некоторые заинтересованные группы (ученые, фермеры, правительства, сельскохозяйственные компании) уже в 1980-х годах стали уделять внимание принципиально иным методам достижения таких задач, как увеличение урожайности, устойчивость сельскохозяйственных систем, улучшение здоровья человека и животных, а также состояния окружающей среды. Одним из направлений является использование новых современных методов для придания растениям новых качеств, таких как устойчивость к засухе, повышенной засоленности почвы или вредителям. Для достижения этих целей был запущен ряд государственных, а позже и частных исследовательских программ.
Разработанный и внедренный в 1980-х годах метод рекомбинантных ДНК стал инструментом, позволяющим преодолеть межвидовую несовместимость. Современная биотехнология использует молекулярные методы для идентификации, выделения и модификации последовательности ДНК, кодирующей специфический генетический признак (например, устойчивость к насекомым) донорского организма (микроорганизма, растения или животного), и встраивания ее в геном организма-реципиента, который в результате приобретает заданный признак.
Существуют различные методы переноса рекомбинантной ДНК в геном организма-реципиента с целью создания ГМО. При работе с растениями используют метод трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens (распространенная почвенная бактерия, имеющая генетические элементы, обеспечивающие встраивание ее генов в хромосомы зараженных клеток растений) и метод «биобаллистики» – «обстреливания» клетки-реципиента наночастицами, нагруженными рекомбинантной ДНК. К методам, применяемым для трансформации различных животных клеток, относятся микроинъекции, электропорация и использование эмбриональных стволовых клеток (FAO/WHO 2003a). Вероятность успеха при трансформации клеток животных ниже, чем при трансформации растительных клеток, и видоспецифична, что обуславливает необходимость тестирования каждого метода на клетках нескольких видов.
Генетическое модифицирование часто позволяет добиться стойкого проялвения желаемых признаков с использованием меньшего количества селекционных поколений и, соответственно, с гораздо меньшими временными затратами, чем традиционная селекция. Кроме того, оно позволяет проводить более точные манипуляции над геномом путем избирательного выделения и переноса исключительно интересующего исследователей гена. Однако, при применении существующих на сегодняшний день методов, встраивание последовательности ДНК в геном хозяина часто происходит случайным образом, что может оказывать непреднамеренное влияние на развитие и физиологию организма. В то же время, подобные эффекты могут проявляться и при использовании традиционных методов селекции. Селекционный процесс, используемый современной биотехнологией, направлен на избежание подобных непреднамеренных явлений и формирование стойких полезных признаков.
Необходимо также отметить, что селекционные программы, использующие традиционные методы, но под контролем молекулярного анализа генетических маркеров, играют важную роль в современной селекции растений и животных. Однако последствия применения таких методик для здоровья человека и окружающей среды в данной работе не рассмотрены.
25. Информация о странах, которые широко используют ГМ - сорта сельскохозяйственных культур.
26. Что такое аптамеры? Возможности использования в биологии, медицине и ветеринарии.
Аптамеры — олигонуклеотидные или пептидные молекулы, специфически связывающиеся с определёнными молекулами-мишенями. Обычно аптамеры получают выбором из больших рандомных библиотек, но также существуют природные аптамеры в рибопереключателях. Они могут использоваться как для фундаментальных исследований, так и медицинских приложениях (макромолекулярные лекарственные препараты, антивирусныеАптамеры могут быть использованы в следующих исследовательских, диагностических и терапевтических задачах.
Для детекции различных молекул – мишеней, как в научных, так и в диагностических задачах. Они могут заменить антитела в Вестерн-блоттинге, во флуоресцентной гибридизации in situ и в методе ELISA.
Перспективным для диагностики форматом является создание чипов со множеством аптамеров и возможностью одновременной детекции многих белков.
Для аффинной очистки молекул-мишеней.
Для эффективного и специфичного ингибирования белков–мишеней. Такое ингибирование может быть использовано как в исследовательских целях, так и для создания новых лекарств. Некоторые такие лекарства уже находятся на стадии клинических испытаний.
Перспективным направлением использования аптамеров является направленный транспорт лекарств. Аптамеры в этом случае определяют адресность доставки (targeting ligands).

Приложенные файлы

  • docx 8732144
    Размер файла: 627 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий