Перспективы использования внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1 и ITS2) для идентификации редких видов растений на прим..


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
Серия «Биология. Экология»
2016. Т. 17. С.
Онлайн
доступ к журналу:
http://isu.ru/izvestia
И З В Е С Т И Я
Иркутского
государстве
ного
университета
��6
М. В. ПРОТОПОПОВА, В. В. ПАВЛИЧЕ
НКО
И ДР.
��Известия Иркутского государственного университета
2016. Т. 1
. Серия «Биология. Экология». С.
кам), что может найти широкое применение в экспертизе ряда товаров, при
пров
едении таможенного и карантинного контроля, в экологическом мон
и-
торинге редких и исчезающих видов. Следует, однако, отметить, что в отл
чие от методов молекулярной филогенетики, ДНК
штрихкодирование м
жет рассматриваться лишь как подход для определения мес
та данного орг
низма в уже существующей
классификации, а не для установления новых
филогенетических связей.
В качестве универсального маркера для ДНК
штрихкодирования ж
вотных используется последовательность 5’
фрагмента гена первой суб
единицы цитохром
оксидазы (CO1 или
cox1
) [6; 7]. Попытки использовать
универсальные маркеры для растений оказались менее успешными. На с
годняшний день наиболее перспективными маркерами считаются внутре
ние транскрибируемые спейсеры ядерных генов рРНК (
ITS
1 и
ITS
2), а такж
некоторые фрагменты пластидного генома (например,
rbcL, matK,
trnH
psbA, atpF
atpH, rpoB, rpoC1, psbK
psbI
и др.) [8; 12
13].
Настоящее исследование направлено на оценку возможности использ
вания нуклеотидных последовательностей ITS1 и
ITS
2 для идентиф
икации
представителей рода
Waldsteinia
Rosaceae
Материалы и методы
В качестве основного объекта исследования была выбрана
Waldsteinia
ternata
(Steph.) Fritsch
. Вид является эндемиком Южной Сибири, относится
к неморальным реликтам и включён в Красные кни
ги Иркутской области и
Республики Бурятия [2
4].
Сбор образцов
проводили из нескольких попул
ций в предгорьях хр. Хамар
Дабан (поймы рек Безымянная, Дулиха, Выдр
ная и Снежная) и Восточного Саяна (пойма
Белая Зима). В работе также
использованы образцы и
з приморских популяций дальневосточного вида
maximowicziana
(Juz. ex Teppner) Probat. (Надеждинский район, окрестн
сти посёлков Раздольное и Сиреневка)
и европейского вида
W. geoides
Willd
(Ботанический сад ИГУ). Свежие неповреждённые листья растений ф
икс
ровали (высушивали) в силикагеле, затем образцы засыпали свежим деги
ратированным силикагелем и хранили в темноте до момента проведения
молекулярно
генетических анализов. В работе были также использованы
несколько экземпляров
ternata
из гербариев СИ
ФИБР СО РАН и ИГУ.
Анализ проводили минимум для пяти особей из каждой популяции. ДНК
выделяли из высушенных листьев СТАВ
методом
[9]
с авторскими модиф
кациями [1]. Амплификацию
ITS
ITS
2 региона проводили в финальном
объёме реакционной смеси 20 мкл с испо
льзованием ДНК
полимеразы
GoTaq Flex
(Promega, США), универсальных праймеров
[11; 14] с финал
ь-
ной концентрацией каждого 250 нМ и отжиге при 52 °С в течение 20 с. Для
выявления основных нуклеотидных вариантов
ITS
ITS
2 региона получе
ные
ампликоны электроф
оретически отделяли от компонентов реакции в
агарозном геле, очищали с помощью набора
GenJet
Extraction
Kit
(Thermo Fisher Scientific, США) и использовали в качестве ДНК
матрицы
для реакции терминирования. Для выявления низкокопийных нуклеотидных
��ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СПЕЙСЕРОВ (ITS1 и ITS2)

вариа
нтов
ITS
ITS
2 региона
очищенные ампликоны лигировали в пла
мидный вектор pTZ57R/T (Thermo Fisher Scientific, США) с последующей
трансформацией
coli
. Плазмиды и исходные ампликоны секвенировали
по методу Сэнгера
с использованием набора реагентов для тер
минирования
BigDye Terminator v. 3.1 (Applied Biosystems, США)
на генетическом анал
заторе
ABI
3500
(Applied Biosystems, США)
. Выравнивание и анализ нукле
тидных последовательностей, а также расчёт генетических дистанций ос
ществляли в программе
EGA
.0.16. Для выравнивания нуклеотидных
последовательностей использовали алгоритм
MUSCLE
, расчёт генетических
дистанций проводили исходя из оптимальной модели нуклеотидных замен
(модель Кимуры).
Результаты и обсуждение
Анализ I
TS
1 региона у особей из всех исс
ледованных популяций не
выявил внутривидовой вариабельности его основных нуклеотидных вар
антов в пределах рода
Waldsteinia
. В то же время были выявлены сущ
ственные межвидовые различия. На рис
1 представлены ДНК
штрихкоды
ITS
1 региона у трёх видов рода
aldsteinia
. Так, было выявлено 7 нукле
тидных замен между
ternata
W. geoides
между
ternata

maximowicziana
между
W. geoides
maximowicziana.
Рис. 1.
ДНК
штрихкоды видов рода
Waldsteinia
, сгенерированные на основе
нуклеотидных п
оследовательностей
ITS
1 региона. Нуклеотиды пре
ставлены в виде
полос, окрашенных в различные оттенки чёрно
белого спектра (А
белый; С
светло
серый;
тёмно
серый;
чёрный). Цветная маркировка и буквенные об
значения указывают на сайты, для которы
х выявлены межвидовые различия. Ци
рами обозначена длина фрагмента в парах оснований
��8
М. В. ПРОТОПОПОВА, В. В. ПАВЛИЧЕ
НКО
И ДР.
��Известия Иркутского государственного университета
2016. Т. 1
. Серия «Биология. Экология». С.
Таким образом, межвидовые дистанции в пределах рода достигали
, а различия с наиболее близкими последовательностями представит
лей других родов сем.
Rosaceae
(рис. 2). Использование метода м
лекулярного клонирования в клетках
coli
позволило дополнительно в
явить несколько низкокопийных вариантов
ITS
уникальных для отдельных
популяций
ternata
. Эти уникальные варианты, по
видимому, являются
изводными
от основного и имеют несколько дополнительных замен.
Таким образом, наличие в последовательности
ITS
1 сайтов с систем
тическими заменами позволяет идентифицировать виды рода
Waldsteinia
со
ной достоверностью. Кроме того, поскольку в большинстве случа
ев
межвидовая генетическая дистанция превышала 2
, это дополнительно
подтверждает возможность использования
ITS
1 региона для молекулярной
идентификации [6; 7]. Только в паре
ternata
maximowicziana
обн
руженные различия составили около 1
. Довольн
о низкий уровень разл
чий в
ITS
1 регионе может объясняться тем, что на сегодняшний день вид
вая самостоятельность
maximowicziana
неоднозначна, поскольку он был
выделен из
ternata
[5] главным образом на основании географической
изолированности популяц
Тем не менее наличие даже единственной с
стематической замены в ITS1 регионе позволяет однозначно определять и
точник происхождения биологического образца.
Рис. 2.
Межвидовые генетические дистанции (
), рассчитанные исходя из
количества
нуклеотидных различий в
ITS
1 регионе. Показаны значения генетич
ских дистанций и их стандартные ошибки (
Для
ITS
2 региона нами была отмечена высокая внутривидовая и даже
внутрипопуляционная вариабельность (в отдельных случаях более 1
) о
новременно с
низким числом систематических замен, что не позволяет о
нозначно различать близкородственные виды. Стоит отметить, что в наст
ящее время для молекулярной идентификации растений в системе
BOLD
рекомендован именно
ITS
2 регион, однако наши результаты показал
и, что
его использование для видов рода
Waldsteinia
представляется затруднител
ным. Бóльшая эффективность
ITS
1 по сравнению с рекомендованным
ITS
регионом показана также на примере ряда других видов [10]. В дальнейшем
��ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СПЕЙСЕРОВ (ITS1 и ITS2)

нами планируется разработка подхода н
а основе одновременного использ
вания нескольких молекулярных маркеров, включая
rbcL
matK
, использ
ющихся в настоящее время в системе
BOLD
Заключение
Нуклеотидные последовательности ITS1 региона могут быть успешно
использованы для идентификации видов р
ода
Waldsteinia
. Выявляемые с
помощью молекулярного клонирования низкокопийные варианты ITS1 р
гиона могут быть использованы при идентификации отдельных популяций
ternata
. Нуклеотидная последовательность ITS2 региона не может быть в
полной мере рекоменд
ована для установления видовой принадлежности
представителей рода
Waldsteinia
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда
фундаментальных исследований (проекты 16
60135 мол_а_дк, 14
31350
мол_а и 16
00783). Авторы благодарят Байка
льский аналитич
ский центр (ЦКП) СО РАН при Президиуме ИНЦ СО РАН за предоставле
ный доступ к оборудованию, гербарные фонды СИФИБР СО РАН и ИГУ за
предоставление образцов для анализа, Ботанический сад ИГУ за пред
ставленные образцы
geoides
, г.н.с. БПИ Д
ВО РАН
Пробатову и
зам. директора БСИ ДВО РАН
Пименову за помощь в сборе образцов
. maximowicziana.
Список литературы
Использование генетических маркеров для оценки состояния реликтовых
видов растений Байкальской Сибири
Протопопова [и
др.]
/ Вестн. РУДН.
Сер. Экология и безопасность жизнедеятельности.
2015.
Т. 4.
36.
Красная книга Иркутской области.
Иркутск
Время странствий, 2010.
480 с.
Красная книга Республики Бурятия: редкие и находящиеся под угрозой и
чезновения в
иды животных, растений и грибов.
Улан
Удэ
Изд
во БНЦ СО РАН,
2013.
688 с.
Положий
А.
Реликты третичных широколиственных лесов во флоре С
бири
А.
Положий, Э.Д. Крапивкина.
Томск
Изд
во Том. гос. ун
та, 1985.
158 с.
Пробатова Н.С. Семейс
тво Розовые
Rosaceae
Н.
Пробатова,
Барк
лов
/ Флора российского Дальнего Востока.
Владивосток
Дальнаука, 2006.
168.
Шнеер
ДНК
штрихкодирование видов животных и растений
способ
их молекулярной идентификации и изучения биор
азнообразия
Шнеер
/
Журн. общ. биологии.
2009.
Т. 70,
296
315.
Biological identifications through DNA barcodes
D. N. Hebert [et al.]
/ Proc.
Biol. Sci.
2003.
Vol.
270.
313
321.
CBOL Plant Working Group. A DNA barcode f
or land plants
CBOL Plant
Working Group
/ PNAS.
2009.
Vol.
106, N 31.
12794
12797.

Doyle J. J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf ti
sue
J. J. Doyle, J. L. Doyle
/ Phytochem. Bull.
1987.
Vol.
19.
15.
10.
ITS1: a DNA barcode better than ITS2 in eukaryotes?
C.
Wang [et al.]
/
Mol. Ecol.
Resour.
2015.
Vol.
15.
573
586.
��10
М. В. ПРОТОПОПОВА, В. В. ПАВЛИЧЕ
НКО
И ДР.
��Известия Иркутского государственного университета
2016. Т. 1
. Серия «Биология. Экология». С.
11.
History and evolution of alpine plants endemic to the Qinghai
Tibetan Pla
eau:
Aconitum gymnandrum
Ranunculaceae
L. Wa
[et al.]
/ Mol. Ecol.
2009.
Vol.
9,
N 4.
709
721.
12.
Land plants and DNA barcodes: short
term and long
term goals
M. W. Chase
[et al.]
/ Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci.
2005.
Vol.
360.
1889
1895.
13.
Universal Plant DNA Barcode Lo
ci May Not Work in Complex Groups: A
Case Study with Indian Berberis Species
S. Roy [et al.]
/ PLoS ONE.
2010.
Vol.
5,
N 10.
e13674.
14.
Utelli A. Molecular and morphological analyses of European
Aconitum
cies
(Ranunculaceae)
A. Utelli, B. Roy, M
. Baltisberger
/ Plant Systematics and Evol
tion.
2000.
Vol.
224.
195
212.
The Perspectives for the Internal Transcribed Spacer
(ITS1 and ITS2) Application for the Endangered Plant
Species Identification with
Waldsteinia (Rosaceae)
as an E
amp
M. V. Protopopova
V. V. Pavlichenko
A. D. Konovalov
E. D. Zolotovskaya
E. M. Bairamova
, V. V. Chepinoga
2,3
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, Irkutsk
Irkutsk State University, Irkutsk
B. Sochava Institute
of Geography SB RAS, Irkutsk
Abstract.
The study was aimed to estimate the possibility to use the ITS nucleotide s
quences for molecular identification of species from
Waldsteinia
genus (Rosaceae). The
detected levels of intra
and interspecific ITS1 varia
bility allow using this molecular
marker for identification of
Waldsteinia
species. The low copy number variants of ITS1,
revealed by molecular cloning approach, can be used for identification of distinct popul
tions of
W. ternata
. A high intraspecific and
intrapopulation variation of ITS2 region, t
gether with a low number of sy
tematic substitutions do not allow to distinguish these
closely related species. Thus, using of ITS2 region as a molecular marker for
Waldsteinia
genus is very ambiguous.
Keywords:
DNA barcoding, molecular markers,
Waldsteinia,
Baikal Siberia, nemoral
relict species, endangered species, ITS1, ITS2.
Протопопова Марина Владимиро
кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник
Сибирский институт физиол
гии
и биохимии растений СО РАН
664033, г. Иркутск, ул. Лермо
това, 132
тел.: (3952) 42
59
факс: (3952) 51
mail: marina.v.protopopov
[email protected]
Protopopova Marina Vladimirovna
Candidate of Science (Biology),
Senior Research Scientist
Siberian Institute of Plant Physio
ogy
and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov st., Irkutsk, 664033
tel.: (3952) 42
fax: (3952) 51
mail: m
[email protected]
Павличенко Василий Валерьевич
кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник
Pavlichenko Vasiliy Valeryevich
Candidate of Science (Biology),
Senior Research Scientist
��ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СПЕЙСЕРОВ (ITS1 и ITS2)

Сибирский институт физиол
гии
и биохимии растений СО РАН
664033, г. Иркутск, ул. Лермо
това, 132
тел.: (3952) 42
59
факс: (3952) 51
mail: [email protected]
Siberian Institute of Plant Physio
�R�J�\
�D�Q�G��%�L�R�F�K�H�P�L�V�W�U�\��6�%��5�$�6
����
�/�H�U�P�R�Q�W�R�Y��V�W����,�U�N�X�W�V�N��������
�W�H�O���� �����\f���
fax: (3952) 51
mail: vpavlichenk
[email protected]
Коновалов Алексей Дмитриевич
студент
Иркутский государственный
универс
тет
664003, г. Иркутск, ул. К
Мар
са, 1
тел
.: (3952) 24
mail: [email protected]
Konovalov Aleksey Dmitryevich
Student
Irkutsk State University
1, K. Marx st., Irkut
sk, 664003
tel.: (3952) 24
mail: [email protected]
Золотовская Елена Дмитриевна
студент
Иркутский государственный
университет
664003, г. Иркутск, ул. К
Мар
са, 1
тел
.: (3952) 24
mail: [email protected]
Zolotovskaya
Elena Dmitryevna
Student
Irkutsk State University
1, K. Marx st., Irkutsk, 664003
tel.: (3952) 24
mail: [email protected]
Байрамова Эльвира Махаловна
студент
Иркутский государственный
университет
664003, г. Иркутск, ул. К
Мар
са, 1
.: (3952) 24
mail: bairamovaelv
[email protected]
Bayramova Elvira Makhalovna
Student
Irkutsk State University
1, K. Marx st., Irkutsk, 664003
tel.: (3952) 24
mail: [email protected]
Чепинога Виктор Владимирович
доктор био
логически
х наук,
ведущий научный сотрудник
Институт географии им
чавы
СО РАН
664033, г. Иркутск, ул. Улан
Баторская, 1
тел.: (3952) 42
профессор
Иркутский государственный
университет
664003, г. Иркутск, ул. К. Мар
са, 1
тел
.: (3952) 24
mail
�W�R�U
�F�K�H�S�L�Q�R�J�D
�J�P�D�L�O
�F�R�P
�&�K�H�S�L�Q�R�J�D��9�L�F�W�R�U��9�O�D�G�L�P�L�U�R�Y�L�F�K
�'�R�F�W�R�U��R�I��6�F�L�H�Q�F�H�V�� �%�L�R�O�R�J�\�\f��
�/�H�D�G�L�Q�J��5
search Scientist
V. B. Sochava Institute of Geography
SB RAS
1, Ulan
Batorskaya st., Irkutsk, 664033
tel.: (3952) 42
Professor
Irkutsk State Univers
ity
Marx st., Irkutsk, 664003
tel.: (3952) 24
�P�D�L�O���Y�L
�W�R�U��F�K�H�S�L�Q�R�J�D�#�J�P�D�L�O��F�R�P

Приложенные файлы

  • pdf 4863965
    Размер файла: 601 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий