конс_Техн БАР друк


МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
Національний університет ”Львівська політехніка”
інститут хімії та хімічних технологій
кафедра технології біологічно активних сполук, фармації та біотехнології
КОНСПЕКТ ЛЕКЦІЙ
з навчальної дисципліни
“Технологія біологічно активних речовин”
для студентів спеціальності 7(8).12020103 “Технології фармацевтичних препаратів”
Затверджено
на засіданні кафедри ТБСФБ
Протокол №____від_______________ р.
Львів 2013
Конспект лекцій з навчальної дисципліни “Технологія біологічно активних речовин” для студентів спеціальності 7(8).12020103 “Технології фармацевтичних препаратів” упорядника – доц., к.х.н. Стадницької Н.Є.
Упорядник - Стадницька Н.Є. к.х.н., доц.

Рецензенти: к.х.н., доц. Губрій З.В.
к.фарм.н., доц. Лопатинська О.І.

ЗАСТОСУВАННЯ В ФАРМАЦІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ МЕТОДІВ
Збільшення кількості населення на Землі, ріст міст, вирубування лісів, переорювання луків, погіршення екологічної ситуації - все це призводить до зменшення природних ареалів поширення дикорослих рослин, які є безцінним джерелом одержання біологічно активних речовин. Велика кількість рослин знаходиться на грані знищення через бездумну експлуатацію природних сировинних баз. Більшість сучасних фармацевтичних підприємств повертається до випуску лікарських препаратів рослинного походження, які краще сприймаються людським організмом з лікувальною і профілактичною метою. Ціна деяких із таких продуктів на світовому ринку досягає кількох тисяч і навіть мільйонів доларів США за 1 кг. Їх або не можна, або надзвичайно важко синтезувати хімічним шляхом. Внаслідок зменшення природних запасів необхідно шукати відповідні нові джерела для виробництва біологічно активних речовин. Використання сучасних біотехнологічних технологій, які базуються на використанні культури клітин вищих рослин дозволяє одержати біологічно активні речовини, ароматичні речовини, прянощі, барвники, біостимулятори, вакцини, моноклональні антитіла у значних кількостях, за короткий термін часу, на невеликих площах, незалежно від пори року та впливу природних умов. Ця галузь біотехнології є порівняно молодою і не дивлячись на досить великі затрати при налагодженні того чи іншого виробництва є конкурентно спроможною в порівнянні з традиційними методами одержання фармакологічно активних речовин рослинної лікарської сировини. Завдяки здатності клітин синтезувати в культурі вторинні метаболіти виникла галузь промисловості, що здійснює біологічний синтез речовин, необхідних людині.
Вирощування клітинних культур у ферментерах у великих масштабах для одержання біологічно активних речовин подібне до культивування мікроорганізмів. Клітини рослин можна культивувати в контрольованих умовах на живильному середовищі певного складу, на відміну від вирощування рослин у відкритому грунті, де вони часто зазнають неконтрольованого впливу біотичних та абіотичних факторів навколишнього середовища. Культивування клітин рослин у ферментерах забезпечує постійне одержання свіжого матеріалу протягом року незалежно від кліматичних і сезонних змін. Наприклад, у стандартних умовах вирощування з 1 г культивованих клітин за 6-місячний термін (звичайний вегетаційний період інтактної рослини) можна отримати понад 100 т клітинної біомаси.
В даний час промисловий синтез вторинних метаболітов з культури тканин лікарських рослин є дуже перспективним напрямом. В цьому випадку синтез вторинних метаболітов відбувається, в регульованих умовах, тому він не залежить від кліматичних чинників, від пошкодження комахами. Культури вирощують на малих площах на відміну від великих масивів плантацій з необхідними рослинами. Культури клітин рослин можуть синтезувати практично всі класи сполук вторинного обміну, причому досить часто в кількостях, що у декілька разів перевищують їх синтез в цілих рослинах.
ЕТАПИ РОЗВИТКУ МЕТОДУ КУЛЬТУРИ КЛІТИН, ТКАНИН І ОРГАНІВ РОСЛИН
Припущення про можливість культивування клітин поза організмом на штучних живильних середовищах було висловлено ще на початку 20-того століття.
1892 - 1902 р німецькі вчені X. Фехтінг (І. Vochting, 1892), К. Рехінгер (З, Rechinger, 1893), Г. Габерландт (G. Haberlandt, 1902) намагалися вирощувати ізольовані з рослин шматочки тканин, групи клітин, волоски. Тривало ростучих in vitro культур вони не отримали. Проте Рехінгер спостерігав процес утворення калуса сегментами стебла тополі, кореня кульбаби та інших і визначив мінімальний розмір фрагмента, здатного утворити калус. Не досягнувши експериментальних успіхів, ці перші дослідники висловили ряд ідей та гіпотез, реалізованих значно пізніше. Фехтінг вважав, що полярність властива не тільки органам рослини, але і окремій клітині. Габерландт висунув гіпотезу про тотипотентність будь-якої живої клітини рослини.
1902 по 1922 р. не приніс успіхів ботанікам, що працювали над створенням оптимальних живильних середовищ, здатних забезпечити існування і тривале розмноження in vitro ізольованних тканин і клітин рослин. Були отримані перші результати по культивуванню тканин тварин на живильних середовищах з додаванням сироваток. Проте спроби ботаніків виростити ізольовані тканини рослин на середовищах з додаванням екстрактів рослинної тканинини (по аналогії із застосуванням сироваток крові і ембріональної для клітин тварин) були невдалі.
1922 р. Роббінс і незалежно від нього Котте показали можливість культивування на синтетичному живильному середовищі меристеми кінчика кореня томатів і кукурудзи. Ці досліди можна вважати за початок застосування методу культури ізольованих органів рослин.
1932-1939 рр вдосконалення методу культури тканин і клітин вищих рослин, що почалося з робіт американського дослідника Ф.Уайта і французького Р. Готре (1932-1934). Обидва вони повторили досвід Роббінса і Котте, показавши, що ізольоване коріння може рости в культурі необмежено довго, якщо їх кінчики періодично пересаджувати на свіже живильне середовище. Здатність до необмеженого росту при субкультивуванні була продемонстрована пізніше цими авторами для калусних тканин камбіального і паренхімного походження (R. Gautheret, 1934), а також для тканин рослинних пухлин (Р. White, 1939).
1940-1960 рр. В цей період збільшилося число видів використовуваних рослин, тканини яких вирощували in vitro. Вперше культуру тканин лікарської рослини отримав Ф. Уайт у 1945 р. від корончастого галу барвінку рожевого Vinca rosea, а в 1947 р. Р. Готре із співробітниками одержав культуру тканин блекоти чорної Hyosciamus niger і показав її здатність синтезувати відповідні алкалоїди. Список, приведений в монографії Р. Готре (R. Gautheret, 1959), включав вже 142 види. Тривалі пересадкові культури успішно отримували з різних органів і тканин рослини. Були розроблені склади живильних середовищ, вивчено значення макро- і мікроелементів для підтримки нормальної ростової активності тканини. Виявлена потреба культур у вітамінах і стимуляторах росту. Оцінено значення натуральних екстрактів типу ендосперма кокосового горіха, каштана, кукурудзи та інших рослин для підтримки неорганізованого клітинного росту і стимуляції процесів органогенезу і соматичного ембріогенезу в культурі калусних тканин і клітинних суспензій. У роботі з культурою тканин відкритий новий клас фітогормонів (цитокініни) і показано значення кінетину та інших N-6-замещених амінопуринів для проліферації клітин in vitro та індукції стеблового морфогенезу (R. Heller, 1953; Z. Kulescha, 1954; I. Nitsch, 1955; C.Miller, F. Skoog, 1955; F. Steward, 1958, P. Р. Бутенко, 1958).
Розроблений метод отримання і вирощування великих мас клітинних суспензій (L. Nickell, W. Tulecke, 1959), а також метод культивування окремої, відділеної з суспензії клітини, ділення якої індукується за допомогою тканини-няньки (L. Jones et al.. 1960; М. К- Павлова, Р. Р. Бутенко, 1965).
1960-1975 рр. запропонований метод отримання ізольованих протопластів з тканин кореня і плодів томатів шляхом обробки їх сумішшю пектолітичних і целюлітичних ферментів (Е. Cocking, 1960). Знайдено умови культивування ізольованих протопластів, при яких вони утворюють нову клетинну стінку, діляться і дають початок клітинним лініям, здатним у ряді випадків до морфогенезу (I. Такеbе et al., 1971). Разом, з тим ізольовані протопласти, що ще не утворили клітинну стінку, були використані для розробки методів гібридизації соматичних клітин шляхом злиття протопластів за допомогою поліетиленгліколя (ПЕГ) і введення в них вірусних РНК, клітинних органел, клітин бактерій. Перші соматичні гібриди послужили моделями для вивчення поведінки ядерного і цитоплазматичного геномів партнерів в гібридних клітинних лініях і в потомстві соматичних гібридів рослин, що регенерували з гібридних клітин (Р.Р. Бутенко, 1979, Ю.Ю. Гліба, 1980). Розроблений метод культури меристем, що дозволяє отримувати тестовані на відсутність вірусів та інших патогенів рослини. За допомогою цього ж методу безвірусні рослини з високим коефіцієнтом розмножуються. Метод широко використовується для отримання оздоровленого посадочного матеріалу багатьох економічно важливих рослин.
Продовжується розробка методів і апаратури для глибинного культивування клітин.
Вперше отримані і вивчені рослини-регенеранти тютюну, що являють собою сомаклональні варіанти початкової форми (Н.Загорська та ін., 1967).
На початку 70-х років XX ст. стало зрозуміло, що культивовані іп vitrо клітини вищих рослин можна використовувати у виробництві як джерело цінних алкалоїдів, ферментів, глікозидів, ефірних олій, що призвело до появи перших патентів в галузі розробки біореакторів (ферментерів) з метою отримання великих кількостей клітинної біомаси. Серед перших таких робіт слід назвати метод вирощування клітин в рідкому середовищі в культуральних посудинах місткістю 20; 30 і 135 л (дм3), перемішування та аерація в яких відбувається продуванням середовища стерильним повітрям. У 1976 р. японські дослідники в результаті великомасштабного культивування отримали біомасу клітин тютюну об'ємом 20 м3.
Першою промисловою клітинною біотехнологією лікарських рослин стало одержання біомаси калусної культури тканин женьшеню, розпочате на заводах СРСР у 1972 р. Промисловий штам калюсної культури женьшеню БИО-2 був створений на основі калюсу, одержаного Р.Г. Бутенко у 1960 р. Детальне фармакологічне вивчення клітинної біомаси женьшеню, проведене Л.І. Слепян у 60-х роках в Ленінградському хіміко-фармацевтичному інституті, оптимізація умов вирощування та складу живильного середовища, проведені Н.Ф. Пісецькою, розробка технології великомасштабного вирощування біомаси, виконана І.В. Александровою у Всесоюзному НДІ «Біотехніка», завершилась створенням промислового регламенту, широко впровадженого в 70-х роках на заводах Головмікробіопрому СРСР. У 1991 р. клітинну біомасу женьшеню одержували на 15 заводах (в тому числі на чотирьох заводах в Україні) щорічно, починаючи з 1988 р., понад 2500 кг в перерахунку на суху біомасу. В ці роки на світовому ринку вартість сухого кореня дикорослого женьшеню була в межах 200—300 тис. дол. США, плантаційного - 20—30 тис. дол. США, ціна 1 кг сухої біомаси культурального женьшеню на внутрішньому ринку СРСР була приблизно 1500 дол. США (в межах 1300—1500 руб.). Це дало змогу застосовувати екстракт клітинної біомаси женьшеню не лише для випуску лікарського препарату «Біоженьшень» (з 1989 р.), а й, починаючи з 1972 р., випускати широкий спектр косметичних і харчових товарів, зокрема напоїв, з добавками такого екстракту. Наприкінці 80-х років в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України створено новий клітинний штам женьшеню, БІО-2МК, який накопичує тритерпенових глікозидів у декілька разів більше, ніж штам БІО-2 (рис.1), він успішно використовувався як лікарська сировина.
З кінця 70-х років в СРСР, в тому числі на двох заводах України, впроваджена технологія одержання клітинної біомаси родіоли рожевої. Ця технологія розроблена у Всесоюзному НДІ «Біотехнологія» на основі клітинного штаму, одержаного І.В. Александровою і А.Н. Даніліною, схарактеризованого і паспортизованого в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України (В.А. Кунах, О.І. Свідченко). Клітинну біомасу родіоли використовували головним чином в парфумерному та косметичному виробництвах.
1976-1985 рр. розроблені метод електрозлиття ізольованих протопластів (U. Zimmerman, 1983) і методи селекції гібридних клітин. З використанням ізольованих протопластів і векторів, створених на основі Тi-плазміди Agrobacterium tumefaciens, створений ефективний спосіб перенесення генів для дводольних рослин.
Методи мутагенезу і клітинної селекції, отримання сомаклональних варіантів і експериментальних гаплоїдів застосовуються для створення нових форм і сортів сільськогосподарських рослин.
Методи скринінгу біохімічних мутантів привели до появи продуктивніших і пристосованих до умов культивування клітинних штамів, використовуваних в промисловості. Виникли методи іммобілізациі культивованих кліток з метою біотрансформації хімічних сполук.
В Японії у 1983 р. отримана перша промислова партія чистої речовини - нафтохінонового барвника шиконіну з біомаси культивованих клітин горобейника лікарського масою 40 кг для виготовлення губної помади найвищого гатунку. Другою в світі технологією отримання чистої речовини було виробництво в Україні з 1987 р. на Харківському виробничому хіміко-фармацевтичному об'єднанні «Здоров'я» алкалоїду аймаліну, що використовується для виготовлення протиаритмічних лікарських препаратів. Ця технологія розроблена на основі найпродуктивніших клітинних штамів К-20 та К-27, отриманих співробітниками Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (В.А. Кунах та ін.) та Ленінградського хіміко-фармацевтичного інституту (О. Г. Воллосович та ін.).
ОСНОВНІ ТЕРМІНИ І ПОНЯТТЯ ДИСЦИПЛІНИ
2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота
6-БАП - 6-бензиламінопурин
In vitro - вирощування живого матеріалу «в склі» (пробірці, колбі, біореакторі), на штучних поживних середовищах в асептичних умовах.
In vivo – вирощування живого матеріалу в природних умовах.
Адвентивні бруньки – бруньки, які утворюються не в пазусі листка, а в інших місцях тіла рослини. Можуть виникати з довільної групи живих клітин, які набувають здатності ділитися.
Андрогенез - отримання гаплоїдних рослин на штучному живильному середовищі із ізольованих пиляків і пилку.
Апекс - верхівкова частина стебла або кореня.
Апікальне домінування - явище пригнічення росту бічних бруньок пагона у присутності термінальної бруньки.
Ауксини - фітогормони (ІОК, НОК, 2,4-Д), які активізують ріст стебел і коріння, стимулюють утворення коріння у проростків.
Біотехнологія – напрямок сучасної науки і техніки, основним завданням якого є використання живих організмів і біологічних процесів у виробництві. Термін “біотехнологія” походить від грецьких слів “bios” – життя, “techne” – майструвати, “logos” – вчення. Отже, це науковий напрямок, який поєднує можливості біології і техніки, коли біологія стає основою численних технологій.
Біотехнологія рослин – це сукупність технічних прийомів для модифікації, покращення, створення та розмноження рослинних організмів, одержання з них корисних речовин.
Вектор – молекула ДНК, що має здатність до автономної реплікації в клітині-хазяїні, в яку можна ввести додатковий фрагмент чужорідної ДНК і надалі забезпечити його реплікацію (як вектор можна використовувати плазміду).
Гаплоїд - ядро, клітини, організм, що характеризується набором хромосом, що представляє половину повного набору, характерного виду
Генетична трансформація – перенесення чужорідних генів та інших носіїв спадковості у клітини рослин, тварин і мікроорганізмів, отримання трансгенних організмів з новими або покращеними властивостями і ознаками.
Дедиференціація– перехід спеціалізованих клітин до проліферації і неорганізованого каллусному зростання (втрата клітинами спеціалізації).
Гібереліни - фітогормони (ГК та ін.), які активізують ріст стебел, викликають проростання насіння.
ГК - гіберелінова кислота
Дедиференціація — перехід спеціалізованих, клітин, що неділяться до проліферації.
Диплоїд - ядро, клітини, організм, що характеризується подвійним набором гомологічних хромосом, представленим числом, характерним для цього виду (символ 2n).
Диференціація — комплекс процесів, що приводять до відмінностей між дочірніми клітинами , а також між материнськими і дочірніми клітинами.
Диференціювання - стан спеціалізації клітин, що відрізняє їх від інших.
Домінант - ген, що проявляється як ознака за умови, коли гомологічні набори мають різні гени.
Експлант - фрагмент тканини або органу, що інкубується самостійно або використовується для отримання первинного калусу.
Електропорація – метод перенесення генів у ізольовані протопласти за допомогою електричного розряду, який викликає утворення пор в клітинній мембрані.
Ембріоідогенез - процес утворення зародкоподібних структур (ембріоїдів) нестатевим шляхом в культурі тканин і клітин in vitro.
Епігенетичні варіації - фенотипічне вираження диференциальної активності генів. Від мутацій і сомаклональных варіацій відрізняються тим, що не зберігаються в циклі клітина-рослина-клітина.
Еуплоїд - ядро, клітини, організм з числом хромосом, кратним Х.
Злиття ізольованих протопластів - формування однієї клітини з двох і більше шляхом об'єднанням їх поверхневих мембран.
Інокулюм - частина клітинної суспензії, що використовується для пересадки на свіже середовище.
ІОК - в-індолілоцтова кислота
Ізольований протопласт – це рослинна клітина, позбавлена клітинної стінки ферментативним або механічним способом.
Калус - група дедиференційованих клітин, що виникли in vivo або in vitro шляхом неорганізованої проліферації.
Каріотип - набір хромосом, характерних для цього виду.
Клітинна селекція in vitro - метод виділення клітин мутантів і сома-клональных варіацій за допомогою селективних умов.
Клон – сукупність генетично однорідних клітин (особин), що виникли в результаті ділення однієї клітини.
Клональне мікророзмноження або мікроклональне розмноження - одержання in vitro нестатевим шляхом рослин, генетично ідентичних початковим.
Кріобіологія (від грецького kryos – холод, мороз, лід) – розділ біології, який вивчає дію на живі системи низьких та наднизьких температур (від 00С до абсолютного нуля).
Культивування ізольованих протопластів - вирощування клітин, позбавлених клітинних стінок, в рідкому або на агаризованому середовищі, що містить як додатковий компонент осмотично активну речовину (стабілізатор) в оптимальній для даного виду концентрації. При регенерації стінок в ізольованих протопластів культура перетворюється на культуру клітин.
Культура "звиклих" тканин - вирощування тканин, що виникли шляхом редиференціації або мутації клітин нормальних калусных тканин, здатних рости на поживних середовищах без гормонів.
Культура експлантів - інкубація в стерильних умовах на поживних середовищах, які викликають, або не викликають проліферацію сегментів, ізольованих із різних органів рослин.
Культура зиготичних зародків in vitro - асептичне вирощування на штучному поживному середовищі незрілих або зрілих ізольованих зародків.
Культура ізольованих протопластів - вирощування клітин, позбавлених стінок, в рідкому або на агаризованому середовищі, що містить як додатковий компонент осмотично активну речовину (стабілізатор) в оптимальній для цього виду концентрації. При регенерації стінок ізольовані протопласти перетворюються на культуру клітин.
Культура калусів in vitro - вирощування в тривалій пересадковій культурі калусів, що виникли шляхом дедиференціації і проліферації клітин, тканин, органів рослин.
Культура калусних тканин - вирощування в тривалій пересадочній культурі тканин, що виникли шляхом проліферації клітин ізольованих сегментів різних органів або цілих органів (пиляки, сім'ябруньки і т. д.) рослин.
Культура клітин (суспензійна культура) - вирощування окремих клітин або невеликих груп у завислому стані в рідкому середовищі при використанні апаратури, яка забезпечує аерацію і перемішування.
Культура коріння in vitro - асептичне вирощування на штучному живильному середовищі в пересадковому режимі ізольованого коріння.
Культура меристем in vitro - асептичне вирощування на штучному поживному середовищі ізольованого апексу або пазушної бруньки пагона конуса наростання.
Культура окремих клітин - вирощування одиночних клітин при низькій щільності висіву: 1) на дуже багатих поживних середовищах, 2) за допомогою культури «няньки» або 3) живлячого шару.
Культура органів in vitro - асептичне вирощування на штучному поживному середовищі в пересадковому режимі ізольованого коріння, стеблових апексів, незрілих частин
Культура пухлинних тканин - вирощування в тривалій культурі сегментів, ізольованих із рослинних пухлин різного походження і звільнених від патогенів, які індукували розвиток пухлини.
Лінія - культура, що виникла із штаму шляхом селекції або клонування і має маркерні ознаки.
Меристема - твірна тканина з дрібними клітинами, що активно діляться.
Меристемоїди – це морфогенетично компетентні клітини, які відповідають на індуктори диференціації і склад середовищ формуванням пагонів, коренів, зародка.
Мікроклональне розмноження - це безстатеве вегетативне розмноження в культурі in vitro, при якому отримують рослини генетично ідентичні вихідній батьківській формі, що сприяє збереженню генетично однорідного посадкового матеріалу.
Мітохондріон – сукупність генетичного матеріалу мітохондрій клітини.
Моноплоїд - ядро, клітина, організм, що характеризуються основним числом хромосом в поліплоїдній серії (символ Х).
Морфогенез in vitro - процес формоутворення, росту і розвитку клітин (цитогенез), тканин (гістогенез) і органів (органогенез) в культурі клітин і тканин in vitro.
Мутація - зміни в генетичному матеріалі клітин шляхом перебудови ДНК ядер і органел, змін в структурі хромосом або рівні плодоїдності організму.
НОК - б-нафтилоцтова кислота
Омніпотентність ядер - збереження ядрами соматичних клітин рослин усіх потенцій ядра зиготи, тобто збереження усієї генетичної інформації.
Органогенез – процес виникнення в калусній тканині зародків органів (коренів і пагонів).
Парасексуальна гібридизація – див. соматична гібридизація.
Парасексуальний гібрид – див. соматичний гібрид.
Плазміда – невелика кільцева молекула ДНК, здатна до стабільного, не зв’язаного з хромосомами існування і автономної реплікації (біосинтез дочірніх ДНК). Плазміди можуть вбудовуватися у хромосоми. Плазміди локалізовані в цитоплазмі бактеріальних клітин і клітинах деяких дріжджів.
Плазмон – сукупність генетичного матеріалу клітини; включає, зокрема, гени пластид (пластом) і мітохондрій (мітохондріон), тобто всі гени, які знаходяться поза ядром.
Пластом – сукупність генетичного матеріалу пластид клітини.
Поліплоїд - ядро, клітини, організм, що характеризуються помноженим основним числом хромосом (символ 3Х, 4Х і так далі).
Популяція клітин - сукупність культивованих клітин .
Проліферація - новоутворення клітин і тканин шляхом розмноження вже існуючих.
Протокорми – особливі ембріональні структури у орхідей, які здатні до вегетативного розмноження.
Псевдодиплоїд - ядро, клітини, організм, що характеризуються диплоїдним числом хромосом, відрізняються від зигот цього виду по каріотипу.
Регенерант – рослина, яка виникла в результаті морфогенезу в культурі ізольованих тканин, клітин рослин.
Регенерація - відновлення цілісного організму з клітини, тканини, органа.
Редиференціація - перехід спеціалізованих клітин із одного стану диференціації в інший із попереднім поділом або безпосередньо.
Редиференціація - перехід спеціалізованих клітин з одного стану диференціювання в інший з попередніми поділами або безпосередньо.
Рекомбінантна ДНК – ДНК, яка утворюється коли ділянки ДНК одного чи різних організмів об’єднуються за допомогою ферментів.
Рекомбінантний ген – ген, який складається із компонентів різних генів.
Рекомбінація – зміна положення генів у хромосомах.
Рецесив - ген або генетично обумовлена ознака, що проявляється в диплоїдній клітині або організмі за умови, коли обидва набори хромосом несуть ці гени.
Ризогенез - процес заставляння, зростання і розвитку коріння.
Рослина-регенерант – див. регенерант.
Ростовий цикл - ріст популяції клітин в циклі періодичного вирощування, що характеризується сигмоїдальною (S-подібною) кривою. Фази ростового циклу: латентна (лаг-фаза), експоненціальна (балка-фаза, фаза логарифмичного росту), уповільнення росту, стаціонарна, деградації.
Сомаклональні варіації і варіанти – фенотиповий прояв непостійності геномів ядра та органел рослинних клітин. Від справжніх мутацій відрізняються більшою частотою виникнення та комплексністю змін (зміни в структурі генів, хромосом, геномів).
Соматична (парасексуальна) гібридизація - гібридизація рослин в обхід статевого схрещування, що залучає до генетичної рекомбінації хромосоми і гени ядра і органел поза сексуальним циклом, наприклад, шляхом злиття ізольованих протопластів. Призводить до появи соматичних гібридів-рослин і гібридних клітинних ліній.
Соматичний гібрид – гібридна рослина, отримана шляхом гібридизації соматичних клітин.
Соматичний ембріогенез – це формування зародкоподібних структур (ембріоїдів) із соматичних клітин в умовах in vitro, які при перенесенні на відповідне живильне середовище здатні розвиватися у цілу рослину.
Субкультивування - процес перенесення транспланту або інокулюма в ішу культуральну посудину на свіже поживне середовище.
Субпротопласт - ізольований протопласт, що втратив частину цитоплаз-мы, що зберіг ядро.
Суспензійна культура – див. культура клітинних суспензій.
Тотипотентність — властивість соматичних клітин рослин повністю реалізувати свій потенціал розвитку за певних умов вирощування, тобто реалізувати омніпотентність ядра з утворенням цілого організму.
Трансгенні організми – мікроорганізми. Тварини або рослини з новими ознаками, що кодуються чужорідними генами, які введені у ці організми за допомогою техніки генної або клітинної інженерії.
Трансплантат – частина калюсної або суспензійної культури, яку використовують для перенесення на свіже живильне середовище.
Трансформація – передавання нової генетичної інформації клітині-реципієнту від клітини-донора за допомогою ДНК.
Фітогормони - (гормони рослин) - біологічно активні сполуки, що утворюються в рослинах в малих кількостях, які викликають специфічний ростовий або формоутворюючий ефект.
Хондріон – див. мітохондріон.
Цибрид - рослина, отримана при злитті ізольованого протопласта з цитопластом, протопластом з інактивованим ядром або з энуклеирован-ным протопластом.
Цикл вирощування - період від поміщення інокулюма або калусного трансплантата в свіже середовище до наступного субкультивування.
Цитокініни - фітогормони (кінетин, 6-БАП), які активізують розвиток меристем, стимулюють утворення бруньок.
Цитоплазматичний гібрид – гібрид, який успадкував ядро (ядерні гени) одного з батьків поряд з цитоплазматичними генами обох батьків, або альтернативного батька.
Цитоплазмон – див. плазмон.
Цитопласт - обмежена мембраною ділянка цитоплазми, що виникла при фрагментації ізольованого протопласта.
Час генерації клітини — інтервал часу між двома послідовними клітинними поділами.
Час подвоєння популяції — інтервал часу, за який число клітин в популяціях збільшується вдвічі.
Штам — культура, що виникла після першого субкультивування і складається з багатьох клітинних ліній, що виникли з клітин, присутніх в первинній культурі.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА КАЛУСНИХ КЛІТИН
Вирощування ізольованих клітин і тканин на штучних живильних середовищах в стерильних умовах (in vitro) отримало назву методу культури ізольованих тканин.
Калусна клітина має свій цикл розвитку, аналогічний циклу всіх інших клітин: поділ, розтягування, диференціювання, старіння і відмирання. Ріст калусних тканин підкоряється загальним закономірностям, тобто крива росту калусних тканин має характер S-подібної кривої (ростова крива Сакса) і включає п'ять фаз, тривалість яких неоднакова у різних видів рослин (мал. ).
Перша фаза - латентна, або лаг-фаза, полягає в підготовці клітин до поділу.
Друга - фаза експоненціального росту (логарифмічна). У цей час мітотична активність найбільша, ріст іде з прискореням маса калуса збільшується.
Третя фаза - лінійна, характеризується постійною швидкістю росту калусной маси.
Четверта - фаза сповільненого росту, під час якої інтенсивність поділу клітин різко знижується. Під час п'ятої фази - стаціонарної - маса калусу не збільшується, оскільки відмирання клітин, що почалося, ще компенсується за рахунок їх ділення. Далі наступає відмирання калусу.
Культивовані калусні клітини і тканини зберігають багато фізіологічних особливостей, властивих клітинам рослини, з якої вони були отримані. Зберігаються, наприклад, такі властивості, як морозостійкість, стійкість до абіотичних чинників (температура, засолення, фотоперіодична реакція), а головне, хоча і різною мірою, здібність до синтезу вторинних метаболітів. Разом із загальними у калусних клітин з'являються свої, характерні тільки для них особливості. Наприклад, при тривалому культивовані in vitro клітини вищих рослин, як калусні, так і суспензійні, утворюють специфічну популяцію, що відноситься до типу нестатевих, тобто популяцію соматичних клітин. Найбільш характерні властивості цієї популяції - фізіологічна асинхронність і генетична гетерогенність.
Фізіологічна асинхронность - полягає в тому, що в кожен даний момент часу клітини знаходяться в різних фазах росту: одні діляться, інші ростуть, а треті вже старіють. Тому загальний фізіологічний стан такої популяції прийнято оцінювати за станом більшості клітин. Асинхронність - стійка властивість популяції калусних клітин. Якщо за допомогою специфічних дій синхронізувати проліферацію клітин популяції, то вже через 3-4 ділення вона знов стає асинхронною.
Причини виникнення асинхронності дуже різноманітні:
1. Особливості виду, сорту, генотипу індивідуальної рослини, а також особливості експланта.
2. Стреси при культивуванні, наприклад неоптимальний склад живильного середовища для даного виду клітин.
3. Зміна балансу ендогенних гормонів і концентрації в середовищі екзогенних гормонів протягом вирощування.
4. Генетична гетерогенність клітин і клонів.
5. Аномалія мітотичного циклу клітин in vitro.
6. Фізичні чинники (температура, світло, аерація).
Генетична гетерогенність - властивість клітин соматичної популяції (нестабільність генома і їх генетична гетерогенність). Генетично стабільними вважаються тільки клітини меристематичних тканин. У клітинах решти тканин при культивуванні можуть виникати поліплоїдія, анеуплоїдія, хромосомна аберація, генні мутації. Проте генетичну гетерогенність не можна розглядати як недолік, оскільки вона є необхідною умовою існування популяції клітин і служить основою для їх адаптації.
Як причини появи генетичної гетерогенності можна назвати наступні:
1. Генетична гетерогенність початкового матеріалу. У рослинах клітини характеризуються різною плоїдністю, диплоїдні тільки меристематичні клітини, що активно діляться.
2. Порушення корелятивних зв'язків при виділенні первинного експланта з рослини.
3. Дія компонентів середовища. Екзогенні гормони і стимулятори можуть проявляти мутагенну дію. Ауксини, особливо 2,4-d, що входять до складу поживних середовищ, - мутагени; цитокініни сприяють поліплоїдизації клітин.
4. Тривале субкультивування, при якому накопичуються генетично змінені калусні клітини.
Після 5-6 пересадок новий каріотип клітинної популяції, як правило, стабілізується, якщо умови культивування залишаються постійними. Інакше зміна фізичних або трофічних чинників приведе до нових генетичних змін.
Генетична нестабільність калусних клітин має велике значення для селекційної роботи, оскільки дозволяє відбирати штами клітин із зміненим генотипом. Ці клітини можуть володіти унікальними властивостями: підвищеною стійкістю до несприятливих чинників, підвищеною продуктивністю і так далі. Проте генетична гетерогенність популяцій калусних клітин в культурі не впливає на збереження в їх геномі основних якостей виду і рослини-донора.
Гормонезалежність. Хоча гормони і викликають мутації, калусні тканини більшості рослин утворюються тільки в присутності в поживному середовищі і ауксинов, і цитокінінів. Виняток становлять, наприклад, незрілі зародки пшениці і сім'ядолі соняшника. Перші утворюють калусную тканину на поживному середовищі з 2,4-d, але без цитокінінів. Другі, навпаки, - на середовищі, що містить цитокініни,але без ауксинів.
При тривалому культивуванні практично у всіх тканин може виникати специфічна властивість гормонезалежності, тобто автономності по відношенню до ауксинів і цитокінінів. Ці тканини можуть рости на середовищі без гормонів, що робить їх схожими на пухлинні клітини і різко відрізняє від нормальних калусних тканин. Зовні ж такі гормонезалежні тканини нічим не відрізняються від калусних. Клітини, які в процесі культивування набули властивість автономності від присутності в середовищі гормонів, називаються «звиклими». Тканини, утворені такими «звиклими» клітинами, називають «хімічними пухлинами» на відмінність від рослинних або генетичних пухлин. Генетичні пухлини виникають на міжвидових гібридах рослин. Рослинні пухлини мають бактеріальне або вірусне походження. Найчастіше рослинні пухлини виникають при попаданні в рослини агробактерій. Так, Agrobactehum tumefaciens викликає утворення корончатих галлів, A. rhizodenes - бородатого кореня, А. гии - стеблового галла. Перетворення рослинних клітин на пухлинні пов'язане з проникненням в них ДНК бактеріальної клітини, так званої ti-плазміди, яка значно змінює властивості клітини, зокрема експресирує гени, контролюючі синтез ауксинів і цитокінінів. Гормоннезалежність «звиклих» клітин пов'язана із зміною активності власних генів, відповідальних за синтез білків-ферментів, що беруть участь в синтезі гормонів. Таким чином, «звиклим» тканинам і рослинним пухлинам в рівній мірі властива гормоннезалежність, але у рослинних пухлин вона носить генетичний характер. У «звиклих» клітин ця властивість досягається головним чином за рахунок епігеномних змін. Існує ще одна особливість, що дозволяє відрізнити «звиклі» і пухлинні клітини від звичайних калусних. Зазвичай ні пухлинні, ні «звиклі» тканини не здібні до нормальної регенерації. Вони можуть утворювати потворні органоподобниє структури, так звані тератоми. В окремих випадках у тривало культивованих тканин вдається відсунути поріг «звикання» завдяки зміні складу поживних середовищ і добитися регенерації нормальної рослини.
ВИКОРИСТАННЯ МЕТОДУ КУЛЬТУРИ ІЗОЛЬОВАНИХ КЛІТИН І ТКАНИН В СИНТЕЗІ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН
КУЛЬТУРА КЛІТИН ЯК ПРОДУЦЕНТ ВТОРИННИХ СПОЛУК
Здатність інтактних рослин синтезувати різні сполуки привела до припущення, що тією ж властивістю володітимуть клітини і тканини цих рослин, що вирощуються в стерильних умовах. У 50-х роках минулого століття це було доведено на практиці. Але в окремих випадках клітини або не проявляли здібності до синтезу необхідних речовин, або синтезували їх в мінімальних кількостях. Знадобилися довгі експерименти по підбору поживних середовищ, умов культивування, дослідженню нових штамів, отриманих завдяки генетичній гетерогенності калусних клітин або застосуванню мутагенних чинників, щоб добитися серйозних успіхів в цій області. Одержання клітинних культур для виробництва біологічно активних речовин можливе з будь-якої тканини або органа цілої рослини, вирощеної у відкритому чи закритому ґрунті, а також часто для цього використовують стерильні проростки, отримані з насіння в умовах іп vitrо.
Синтез вторинних метаболітів звичайно здійснюється після завершення клітинного росту, маса їх порівняно незначна і лише внаслідок специфічних умов культивування і мутаційних змін можливо викликати надсинтез вторинних метаболітів. Вторинні метаболіти синтезуються у вигляді комбінації кількох різних хімічних сполук.
Деякі з цих речовин, наприклад окремі органічні кислоти, що утворюються в рослинах, відразу використовуються клітинами для різних біосинтетичних процесів; вони не накопичуються в рослинах у великій кількості і є проміжними продуктами обміну речовин. Для виділення їх із рослин інколи потрібно перервати або якимось чином змінити ланцюг закономірних перетворень речовин у клітині, тобто відвернути подальше використання цих речовин. Найчастіше це вдається зробити шляхом індукції та добору відповідних біохімічних мутацій. Рослини з такого типу мутаціями, як правило, не життєздатні, але можливо отримати подібні мутації на клітинному рівні за допомогою методів клітинної селекції
Багато речовин вторинного метаболізму — це найважливіші фізіологічно активні речовини, наприклад терпеноїди (сюди належать регулятори росту гібереліни) або убіхінони та пластохінони, які відіграють найважливішу роль у процесах дихання та фотосинтезу. Тому термін «речовини вторинного метаболізму» поступово замінюється на термін «речовини спеціалізованого обміну». Деякі з цих речовин значною мірою визначають харчові та смакові якості різних рослинних продуктів, багато з них широко застосовують в медицині, харчовій та косметичній промисловості, техніці.
Завданнями майбутніх досліджень, здатних перетворити біотехнологію лікарських рослин і фітопрепаратів на рутинну промислову технологію, є поглиблене вивчення генетики вторинного метаболізму; виділення та клонування відповідних генів, що дають змогу створювати високопродуктивні штами і генетично-модифіковані рослини із застосуванням сучасних методів генетичної інженерії (метаболічна інженерія біосинтезу вторинних метаболітів); подальше удосконалення промислової технології вирощування ізольованих органів, тканин і клітин рослин шляхом її спрощення; здешевлення технологічного обладнання біотехнологічних виробництв.
Різними вченими в різні періоди було одержані ті чи інші природні сполуки з культур тканин, властиві інтактним рослинам. Одержані здобутки можна представити у вигляді таблиці.
Таблиця
Рослини Вторинний метаболіт
Блекота чорна Hyosciamus nigeri Гваюла Parthenium argentatum каучук
Беладонна Atropa beladonna - атропін - алкалоїд
Мак снодійний Papaver somniferum Кодеїн - болезаспокійлива речовина
Наперстянка Digitalis lanatd Діоксин - тонізує серцеву діяльність
Хінне дерево Cinchona ledgeriana антималярійний засіб «хінідин».
Тютюн N. tabacum скополетин і чотири глікозиди, три з яких ідентифіковані як скополин, фабіатрин і b-гентибіозид.
Агава А. toumeyana синтезують гекогенін - попередник стероїдних гормонів.
Діоскорея D, composita Діосгенін - попередниками стероїдних гормонів.
Клітинна біотехнологія лікарських рослин бурхливо розвивається в різних країнах у промислових масштабах одержують убіхінони, антоціани, алкалоїди.
Вивчались особливості росту культури тканин женьшеню Pаnаx ginseng, барвінку Vinca rosea, раувольфії Rauwolfia serpentina, стефанії Stephania rotunda та деяких інших представників родини аралієвих, різних видів роду раувольфія.
Культури тканин різних видів рослин здатні синтезувати антимікробні сполуки, які діють проти грампозитивних мікроорганізмів. Ці біологічно активні речовини виявляються як у вихідній рослині, так і в культурі її тканин, а в деяких випадках лише в культивованих клітинах за повної відсутності в інтактних рослинах.
У зв'язку з високою фармацевтичною цінністю стероїдних гормонів встановлена перспективність використання калусних і суспензійних культур агави А. toumeyana та діоскореї D, composita для їх виробництва.
Не менша увага приділяється і культурам тканин рослин, які в природі накопичують глікозиди, особливо карденоліди - серцеві глікозиди. На наявність глікозидів були досліджені культури тканин представників видів Атті, Aросупит, Cheiranthus, Cytisus, Digitalis, Iberis, Oleander, Periploca, Taxus, Urginea, Vincetoxicum. Найінтенсивніше вивчались види роду наперстянок Digitalis, які є основною сировиною для промислового одержання серцевих глікозидів. Культури тканин різних органів видів Digitalis lanata, D. purpurea, D. mertonensis здебільшого карденоліди накопичують дуже мало (не більше 0,02 %) і лише протягом перших субкультивувань, до того ж синтезовані сполуки не завжди аналогічні глікозидам інтактних рослин. Тому метою досліджень було вивчення біотрансформації глікозидів і попередників їх біосинтезу культурами ізольованих тканин і клітин.
Великий інтерес викликало відкриття піретринів, виділених з квіток Chrysanthemum cinerariaefolium. Ці речовини - могутні інсектициди. Особлива їх цінність полягає в тому, що піретрини не викликають звикання у комах, а також не проявляють кумулятивного токсичного ефекту.
Синтез вторинних метаболітів в культивованих клітинах пов'язаний з внутрішньою органелою, в основному з пластидами і ендоплазматичним ретикулумом. У клітинах, не здатних до транспорту метаболітів, продукти вторинного синтезу зазвичай накопичуються у вакуолях і вільному просторі (ВП) клітин (табл. 1).
Таблиця 1
Внутрішньоклітинна локалізація синтезу і накопичення вторинних метаболітов (по Р.Г.Бутенко, 1999)
Внутрішньоклітинні метаболіти Синтез Накопичення
Алкалоїди Пластиди, цитоплазма Вакуоль, хлоропласти, ВП
Терпеноїди:
Монотерпени
Тритерпени Лейкопласти
Хлоропласти, лейкопласти ВП
Вакуоль, ВП, цитоплазма
Феноли:
Флавоноїди
Таніни
Кумаріни
Оксикоричні кислоти Хлоропласти
Вакуоль, пластиди
Вакуоль, хлоропласти ЕПР,
ЕПР, хлоропласти, мітохондрії Вакуоль, хлоропласти, ВП Вакуоль, ВП, ЕПР
Вакуоль
Вакуоль, ВП, хлоропласти
Ціаногенні глікозиди ЕПР Вакуоль
Глікозиди ЕПР Вакуоль
Бетаїн Імовірно цитоплазма Вакуоль
Культури клітин деяких рослинних видів здатні синтезувати різноманітні вторинні метаболіти в концентраціях, близьких і навіть більш високих, ніж інтактні рослини. На сьогодні такі високопродуктивні, а також трансформовані культури, в які перенесено гени, що забезпечують синтез цільового продукту, широко використовують в промисловому виробництві біопродуктів. Наприклад, вихід аймаліцина і серпентину в культурі клітин Catharanthus roseus складає 1,3 % сухої маси, а в цілій рослині - 0,26 %. У культурі клітин Dioscorea deltoidea діосгенін синтезується в кількості 26 міліграм на 1 г сухої маси, а в бульбах рослин його вміст складає 20 міліграм на 1 г сухої маси.
Під час культивування клітин і тканин може початися синтез речовин, не характерних для початкової рослини, або розширюється набір сполук, що синтезуються, тобто з'являється можливість одержання нових речовин шляхом додавання до культивованих клітин природних проміжних продуктів, потрібних для біосинтетичних процесів. Такий підхід становить практичний інтерес у разі створення або модифікування лікарських препаратів. У ряді випадків в клітинній культурі утворюються речовини, які синтезувалися інтактною рослиною на ювенільній фазі розвитку, або речовини, що містилися в клітинах філогенетично раніших груп рослин. Так, в культурі клітин Papaver bracteatum міститься сангвірин, характерний для ювенільних рослин, і відсутній тебаїн, що синтезується дорослими рослинами. А в культурі клітин жівокості (Delphinium) синтезуються ∆7-стеріни, присутні у архаїчних груп рослин. На сьогодні відомо понад 100 000 вторинних метаболітів рослинного походження, в культуру іп vitrо введена переважна більшість цих рослин. У книгах видавництва «Шпрінгер» детально описано особливості культури тканин лікарських рослин із близько 300 родів. Деякі з таких культур накопичують в 10-30 разів більше цільового продукту, ніж природні рослини. Відомі приклади, коли кількість вторинного метаболіту перевищує його вміст у рослині в 100 разів (наприклад, для клітин раувольфії зміїної, що накопичують до 20 % алкалоїду аймаліну). За достатньої продуктивності культури і ціни (дол. США) кінцевого біотехнологічного продукту (аймаліцину - 1500 дол./кг, шиконіну - 4000 дол./кг, камптотецину і його похідних – 5000-25 000 дол./кг) технології рентабельні (слід зазначити, що ціна протипухлинного алкалоїду таксолу, що накопичується деякими деревними рослинами роду тис Тахиs, перевищує 200 000 дол./кг). Культури таких клітин вирощують в промислових масштабах, а отриману сировину використовують для виробництва лікарських препаратів. Нині, розробляючи новий фітопрепарат чи препарат на основі природних сполук рослинного походження, як джерело сировини вказують одночасно на інтактні рослини і на клітинну біомасу, вирощену іп vitrо.
Синтез вторинних сполук може корелювати з процесом диференціювання в культурі клітин. Наприклад, в суспензійній культурі Papaver somniferum максимальний синтез алкалоїдів починається після того, як в ній диференціюється достатньо велика кількість спеціалізованих клітин молочних судин, призначених для депонування метаболітів. З іншого боку, культури клітин тютюну і моркви синтезують велику кількість нікотину і антоціану відповідно, хоча їх клітини слабо диференційовані.
Не існує також однозначної відповіді на питання, як пов'язаний синтез вторинних метаболітов з ростовими процесами. У великого числа культур вторинні метаболіти синтезуються і накопичуються в значних кількостях або під час експоненціальної фази, коли ростові процеси особливо активні, або в період стаціонарної фази зростання культури клітин, коли приріст клітинної маси припиняється. Проте є культури, наприклад культура клітин Catharanthus roseus, у яких синтез вторинних метаболітів супроводжує весь період росту.
Важлива особливість культивованої популяції клітин - її стабільність відносно синтезу і накопичення продуктів вторинного синтезу. Так, у відділі біології клітини і біотехнології ІФР РАН під керівництвом Р. Г. Бутенко були отримані різні штами клітин Dioscorea deltoidea, зокрема штам-надпродуцент ІФР ДМ-0,5. Всі ці штами зберігали стабільність відносно синтезу фуростанолових глікозидів біля 26 років. Цікава особливість більшості клітин в культурі полягає в тому, що зазвичай ці клітини не транспортують метаболіти, що синтезуються, в поживне середовище або інші клітини, хоча деякі культури становлять виняток, зокрема культура клітин маку, які депонують алкалоїди в молочних судинах.
Незважаючи на ряд переваг, є багато причин, які стримують виробництво біологічно активних речовин у біореакторах. Здебільшого органи або тканини, що продукують у живій рослині відповідні речовини, внаслідок введення їх у культуру не синтезують ці речовини або синтезують їх у незначних кількостях. Потрібна тривала селекційна робота для того, щоб культура змогла досягти оптимального рівня виробництва біологічно активних речовин.
Порівняно з мікроорганізмами рослинні клітини ростуть повільніше. Для подвоєння рослинних клітин у культурі іп vitrо у середньому потрібно в 20 разів більше часу, ніж із подвоєнням кількості клітин мікроорганізмів. Виробництво у великих масштабах ускладнюється внаслідок того, що слід дотримуватись спеціальних заходів для запобігання повторній інфекції у разі тривалого процесу виробництва.
У багатьох клітинних культур під час виробництва вторинних біопродуктів виявляється нестабільність. Для промислового виробництва потрібні такі клітинні культури, що мають високу продукуючу стабільність. Часто здатність селектованих ліній клітин виробляти відповідні біопродукти в необхідній кількості зменшується після кількох субкультивувань. Механізми, що сприяють протіканню цих важливих процесів, різноманітні й усе ще вивчаються.
Суспензійні культури рослин здебільшого складаються з агрегатів клітин різноманітного розміру. Це означає, що клітини на поверхні агрегату й у його центрі не ідентичні, що ускладнює оптимізацію процесу виробництва вторинних біопродуктів. Встановлено, що під час утворення агрегатів різного розміру між клітинами виникають морфологічні розбіжності, які в умовах масового виробництва поглиблюються ще більше і спричинюють високу гетерогенність культури та ускладнюють ферментативне культивування. Крім того, деякі культури клітин перетворюють позаклітинну сахарозу на полісахариди, які збільшують агрегування клітин. Встановлено, що виробництво відповідного вторинного продукту в потрібній кількості часто пов'язане з індукцією органогенезу клітинної культури. Наприклад, у женьшеню отримані клони, що мають високий вміст глікозидів під час переходу до ризогенезу, а у маку лише в органогенній культурі відбувається біосинтез морфінів. Це створює чимало труднощів за умови масового культивування. Вторинні продукти у більшості рослинних культур не виділяються в середовище, а залишаються усередині клітин. Це властиве культурам, що синтезують алкалоїди (наприклад, раувольфія зміїна), і ускладнює екстрагування. Часто методи екстрагування й очищення відрізняються від методів, що застосовуються для природної рослинної сировини. Внаслідок великих розмірів культивовані клітини рослин чутливі до перемішування і постачання киснем. Все це потребує конструювання спеціальних ферментерів (біореакторів).
ТИПИ КУЛЬТУР КЛІТИН І ТКАНИН КАЛУСОГЕНЕЗУ
Залежно від способу, умов культивування і походження можна виділити декілька типів культур клітин і тканин. Якщо культивування відбувається поверхнево на агаризованому поживному середовищі, то утворюється калусна тканина. При культивуванні в рідкому поживному середовищі (глибинний спосіб культивування) утворюється суспензійна культура клітин. Великий інтерес представляє культура одиночних клітин, а також культивування ізольованих протопластів.
Калусна тканина не має чітко вираженої структури, але може розрізнятися по щільності. Походження і умови вирощування визначають, чи буде калусна тканина рихлою, середньої щільності або щільною. Рихла калусна тканина має сильно оводнені клітини, які легко розпадаються на невеликі групи клітин і кластери і тому може бути використана для отримання суспензійної культури. Тканина середньої щільності характеризується добре вираженими меристематичними вогнищами. У ній легко ініціюються процеси органогенезу. У щільних калусних тканин розрізняють зони редукованого камбію і трахєїдоподібних елементів.
Суспензійна культура клітин утворюються як з калусних тканин, так і безпосередньо з експланта. Серед калусних тканин для одержання суспензійних культур переважно вибирають калуси рихлого типу. При необхідності використовувати щільний каллус, то його можна розпушити, виключивши з поживного середовища солі Са2+. З цією ж метою можна культивувати тканину на середовищі, що містить ауксин 2,4-d або ферменти, - пектиназу (0,2 міліграм/л) і целюлазу (0,01 міліграм/л). Найкращий ефект досягається при додаванні ферментів. Суспензійні культури клітин можна отримати і безпосередньо з експланта по методу Ф. Стюарда. Для цього експлант поміщають в рідке середовище при постійному автоматичному перемішуванні. Дедіфференцированниє клітини відриваються від експланта, утворюючи суспензію в поживному середовищі. Постійне струшування - необхідна умова культивування клітинних суспензій. Суспензійні клітини діляться у присутності тих же двох груп гормонів (ауксинов і цитокинінов), які індукують ділення клітин в каллусних тканинах. Отже, можна сказати, що суспензійні культури представлені різними агрегатами каллусних клітин.
Клітинні суспензії відіграють значну роль в біотехнології. Вони можуть бути використані для отримання ізольованих протопластів, які застосовують для клітинної селекції, при введенні чужорідної ДНК і інших процесах. Клітинні суспензії культивують у великих кількостях для отримання вторинних метаболітов, виявлення нових речовин, для вирощування клітинної біомаси. Проте збільшення клітинної біомаси в результаті ділення клітин і синтез вторинних метаболітов роз'єднані в часі. Тому необхідно добре знати фізіологію, властивості клітин в суспензійних культурах, щоб отримати максимальний вихід продукту. Стан клітинних суспензій характеризується щільністю клітинної популяції. За 14-16 днів (середня тривалість пасажу) щільність зазвичай підвищується від 5•104 до 5•106 кл/мл. Якість суспензії визначається ступенем агрегированноє™. Агрегати повинні містити не більше 10-12 клітин.
Культура одиночних клітин застосовуються в клітинній селекції для відбору гібридних клітин і їх клонування, а також для генетичних і фізіологічних досліджень. Наприклад, питання про причини генетичної неоднорідності легко вирішувати, використовуючи клон-потомство однієї клітини, а не гетерогенну тканину початкового експланта.
Проте культивування однієї або декількох клітин пов'язане з певними труднощами, що полягають в тому, що одиночна клітина живе, але не ділиться в тих умовах, які розроблені для нормального зростання і розмноження клітин каллусной тканини. Тому при культивуванні одиночних клітин було потрібно вироблення спеціальних методів. Всі вони засновані на використанні так званого «кондиціонуючого чинника» - метаболітов, що виділяються клітинами, що в середу діляться. Коли на живильне середовище висаджується одна клітка або невелика їх кількість, вони не діляться, оскільки кондиціонуючого чинника, що виділяється, не вистачає для індукції ділення. Отже, необхідно підвищити концентрацію чинника в поживному середовищі. Цій меті служать наступні методи:
1. Метод тканини-«няньки» - кондиціонуючий чинник виділяється шматочками тканини-«няньки», що знаходяться поряд з одиночною клітиною (мал. 6.1).
Мал. 6.1. Вирощування окремих клітин за допомогою тканини-«няньки» (по Р. Г. Бутенко, 1999):
1 - одиночні клітини; 2 - калусна культура-«нянька»
2. Метод «годуючого шару» - кондиціонуючий чинник виділяють клітини суспензійної культури того ж виду рослин, що активно діляться, що і одиночна клітка (мал. 6.2).

Мал. 6.2. Використання культури суспензійних клітин як «годуючий шар» для вирощування ізольованих протопластів і одиночних клітин кукурудзи (By Дик Куанг, З.Б.Шаміна, 1985):
1 - колонії клітин; 2 - фільтрувальний папір; 3 - алюмінієва сітка; 4 - пінополіуретан; 5 - суспензія клітин
3. Кондиціонування середовища - здійснюється шляхом додавання в нього поживного середовища, відфільтрованого від клітин, що інтенсивно діляться.
4. Метод культивування одиночних клітин - здійснюється в мікрокраплі, тобто в дуже малому об'ємі (20 мкл) багатого живильного середовища (Ю.Ю.Глеба).
Точно сказати, що є кондиціонуючим чинником, поки неможливо. Згідно дослідженням А.І.Павлової і Р. Г. Бутенко (1969), цей чинник водорастворім, термостабілен, не замінюється фітогормонамі, включає низькомолекулярні речовини. Хімічна природа кондиціонуючого чинника доводиться за допомогою задоволеного простого експерименту. Якщо розділити одиночні клітини і ткань-«няньку» скляною пластиною, то ділення клітин не наступає. Якщо замість пластин помістити целофан, то хоча і із затримкою починається ділення одиночних клітин (мал. 6.3).

Мал. 6.3. Доказ хімічної природи чинника кондиціонування:
1 - одиночні клітини; 2 - тканина-«нянька»; 3 - клітини, що діляться; 4 - целофан; 5 - скляні пластинки
ІЗОЛЬОВАНІ ПРОТОПЛАСТИ, ЇХ ОТРИМАННЯ І КУЛЬТИВУВАННЯ
Вперше термін «ізольовані протопласти» був запропонований Д. Ханстейном в 1880 р. Протопласт в цілій клітині можна спостерігати під час плазмолізу. Ізольований протопласт - це вміст рослинної клітини, оточений плазмалемою. Целюлозна стінка у даного утворення відсутня. Ізольовані протопласти - одні з найбільш цінних об'єктів в біотехнології. Вони дозволяють досліджувати різні властивості мембран, а також транспорт речовин через плазмалему. Головна їх перевага полягає в тому, що в ізольовані протопласти достатньо легко вводити генетичну інформацію з органел і клітин інших рослин, прокаріотичних організмів і з клітин тварин. Е. Коккинг встановив, що ізольований протопласт завдяки механізму піноцитозу здатний поглинати з навколишнього середовища не тільки низькомолекулярні речовини, але і крупні молекули, частинки (віруси) і навіть ізольовану органелу.
Велике значення в створенні нових форм рослин для вивчення взаємодії ядерного генома і геномів органели має здатність ізольованих протопластів зливатися, утворюючи гібридні клітини. У такий спосіб можна добитися отримання гібридів від рослин з різним ступенем таксономічної віддаленості, але які володіють цінними господарськими властивостями.
Вперше протопласти були виділені Дж. Клернером в 1892 р. при вивченні плазмолізу в клітинах листка тілорізу (Stratiotes aloides) під час механічного пошкодження тканини. Тому цей метод названий механічним. Він дозволяє виділити лише невелику кількість протопластів (виділення можливе не зі всіх видів тканин); сам метод тривалий і трудомісткий. Сучасний метод виділення протопластов полягає у видаленні клітинної стінки за допомогою поетапного використання ферментів для її руйнування: целюлази, геміцеллюлази, пектинази. Цей метод отримав назву ферментативного.
Перше успішне виділення протопластов з клітин вищих рослин даним методом зроблене Е. Кокінгом в I960 р. В порівнянні з механічним ферментативний метод має ряд переваг. Він дозволяє порівняно легко і швидко виділяти велику кількість протопластів, причому вони не відчувають сильного осмотичного шоку. Після дії ферментів суміш протопластів пропускають через фільтр і центрифугують для видалення незруйнованих клітин і їх осколків.
Виділити протопласти можна з клітин рослинних тканин, культури калусів і суспензійної культури. Оптимальні умови для ізоляції протопластів для різних об'єктів індивідуальні, що вимагає кропіткої попередньої роботи по підбору концентрацій ферментів, їх співвідношення, часу обробки. Дуже важливим чинником, що дозволяє виділяти цілі життєздатні протопласти, є підбір осмотичного стабілізатора. Як стабілізатори зазвичай використовують різні цукру, іноді іонні осмотики (розчини солей Сасl2, Na2hp04, Kc1). Концентрація осмотиків повинна бути небагато гпертонічна, щоб протопласти знаходилися в стані слабкого плазмолізу. В цьому випадку гальмуються метаболізм і регенерація клітинної стінки.
Ізольовані протопласти можна культивувати. Зазвичай для цього використовують ті ж середовища, на яких ростуть ізольовані клітини і тканини. Відразу ж після видалення ферментів у протопластів в культурі починається утворення клітинної стінки. Протопласт, що регенерував стінку, поводиться як ізольована клітка, здатний ділитися і формувати клон клітин. Регенерація цілих рослин з ізольованих протопластов зв'язана з рядом труднощів. Отримати регенерацію через ембріогенез вдалося поки тільки у рослин моркви. Стимуляцією послідовного утворення коріння і пагонів (органогенез) добилися регенерації рослин тютюну, петунії і деяких інших рослин. Слід зазначити, що протопласти, ізольовані з генетично стабільної клітинної культури, частіше регенерують рослини і з великим успіхом використовуються при дослідженнях генетичної модифікації протопластів.
УМОВИ КУЛЬТИВУВАННЯ ІЗОЛЬОВАНИХ ТКАНИН І КЛІТИН РОСЛИН ТА ЇХ ВПЛИВ НА СИНТЕЗ БАР
На біосинтез вторинних метаболітів впливають походження тканин, тривалість їх вирощування іп vitrо, мінеральний склад живильного середовища, рівень, типи і співвідношення екзогенних регуляторів росту, фізичні фактори.
Перш за все вихід продукту залежить від генотипу рослини-донора. Показано, що культури клітин, отриманих від високопродуктивних рослин, продукували більше число метаболітів. Інший важливий чинник - склад поживного середовища і концентрація його компонентів, які повинні забезпечувати, з одного боку, збільшення кількості клітин-продуцентів, з іншого - підсилювати сам процес синтезу. На зростання, тобто на збільшення біомаси, істотно впливає природа і кількість вуглеводів, сполук азоту і фосфору, на синтез метаболітов - природа і концентрація фітогормонів. Так, при заміні одного ауксина на іншій, наприклад нафтилоцтової кислоти на 2,4-d, триразово збільшився синтез антрахінону суспензійною культурою Morinda citrifolia.
У зв'язку з тим що в житті людини найбільше значення мають насінні рослини, методи і умови для їх культивування розроблені краще, ніж для голонасіних рослин або водоростей, вирощування яких в стерильних умовах викликає певні затруднення. Проте незалежно від приналежності рослин до тієї або іншої таксономічної групи існують загальні вимоги до вирощування об'єктів в культурі in vitro.
Асептика. Перш за все культивування фрагментів тканини або органу рослини - експлантів, а тим більше окремих клітин вимагає дотримання повної асептики. Мікроорганізми, які можуть потрапити в живильне середовище, виділяють токсини, що інгібують ріст клітин і що приводять культуру до загибелі. Тому при всіх маніпуляціях з клітками і тканинами при культивуванні in vitro дотримуються певних правила асептики в ламінар-боксі або в асептичних кімнатах. У першому випадку асептика досягається подачею профільтрованого стерильного повітря, направленого з ламінар-боксу назовні, на того, що працює. Асептичні кімнати стерилізують за допомогою ультрафіолетових ламп, а працюють в таких приміщеннях в стерильному одязі. Робочу поверхню столів в асептичних кімнатах і інструменти перед роботою додатково стерилізують спиртом.
Чистий посуд, заздалегідь загорнутий в папір або у фольгу, інструменти, папір, вату стерилізують сухим жаром в сушильній шафі при температурі 160°С протягом 1,5-2 год. Живильні середовища стерилізують в автоклаві при температурі 120°С і підвищеному тиску протягом 15-20 хв. Якщо до складу живильних середовищ входять речовини, що руйнуються при автоклавуванні їх слід стерилізувати шляхом фільтрації через бактеріальний фільтр. Потім стерильні профільтровані компоненти додають в проавтоклавоване середовище, охолоджене до температури 40°С.
Рослинні тканини самі по собі можуть служити серйозним джерелом зараження, оскільки на їх поверхні завжди знаходиться епіфітна мікрофлора. Тому необхідна поверхнева стерилізація, яку проводять наступним чином. Попередньо частину рослини з якої буде вилучено експлант, промивають водою з милом і ополіскують чистою водою. Потім рослинний матеріал стерилізують в розчинах дезінфікуючих речовин. Деякі з цих речовин, а також час стерилізації наведено в таблиці.
Таблиця
Стерилізація початкового рослинного матеріалу
(по Р.Г.Бутенко, 1999)
Об'єкт Час стерилізації, хв
діацид 0,1 %-ний сулема 0,1 %-на перекис водню, 10-12%-ний
Насіння сухе 15-20 10-15 12-15
Насіння набрякле 6-10 6-8 6-8
Тканини стебла 20-40 20-25 -
Листя 1-3 0,5-3 3-5
Апекси 1-10 0,5-7 2-7
Після витримки експлантів в дезинфікуючому розчині їх кілька разів промивають у дистильованій воді і скальпелем удаляють зовнішній шар клітин на зрізах експлантів, оскільки він може бути пошкоджений при стерилізації.
Мікроорганізми можуть знаходитися і всередині рослинної тканини. Найчастіше внутрішнє інфікування зустрічається у тропічних і субтропічних рослин. Тому окрім поверхневої стерилізації іноді доводиться застосовувати антибіотики, які і вбивають мікробну флору усередині тканини. Слідує, проте, відмітити, що подібна обробка не завжди приводить до стерилізації внутрішніх тканин, оскільки важко вибрати антибіотик, що направлено діє.
Живильні середовища. Ізольовані клітини і тканини культивують на багатокомпонентних живильних середовищах. Вони можуть істотно розрізнятися по своєму складу, проте, до складу всіх середовищ обов'язково входять необхідні рослинам макро- і мікроелементи, вуглеводи, вітаміни, фітогормони і їх синтетичні аналоги. Вуглеводи (звичайно це сахароза або глюкоза) входять до складу будь-якої живильної суміші в концентрації 2 - 3%. Вони необхідні як живильний компонент, оскільки більшість калусних тканин позбавлена хлорофілу і не здатні до автотрофного живлення. Тому їх вирощують в умовах розсіяного освітлення або в темноті. Винятком є калусна тканина мандрагори, амаранта і деяких інших рослин.
Обов'язковими компонентами живильних середовищ мають бути ауксини, що викликають дедіференцировку клітин експланта, і цитокініни, що індукують поділ клітин. При зміні співвідношення між цими фітогормонами або при додаванні інших фігогормонів можуть бути викликані різні типи морфогенезу.
Японськими вченими Табата, Фуруя було встановлено, що біосинтез нікотину та інших алкалоїдів (анатабину, анабазину) можна регулювати в калусних тканинах будь-якого, в тому числі стеблового, походження екзогенними стимуляторами росту. Зокрема, в калусній культурі тютюну стеблового походження біосинтез нікотину підвищують, вилучаючи із середовища синтетичний ауксин 2,4-Д і збільшуючи концентрацію кінетину, синтез алкалоїдів (нікотину, анатабину, анабазину), а також деяких кумаринів активує ІОК і пригнічує 2,4-Д.
Високий вміст нітратів, іонів амонія, калія, фосфату сприяє швидкому росту клітин. Виснаження середовища значно знижує ріст і процеси вторинного метаболізму. Проте спочатку низький вміст фосфатів в живильному середовищі здатний стимулювати синтез вторинних метаболітов. Встановлено, що культивування калусів солодки голою на середовищі з половинною концентрацією азоту і фосфору в темноті збільшує зміст фенольних сполук в 1,6 разу в порівнянні з калусами, що росли на повному середовищі. В середовище можуть бути додані ендосперми незрілих зародків (кокосовий горіх, кінський каштан і ін.), пасока деяких дерев, різні екстракти (солодовий, дріжджовий, томатний сік). Введення їх в середовище дає цікаві результати, але такі експерименти важко відтворювані, оскільки компонент, що діє, як правило, точно невідомий. Наприклад, додавання в живильне середовище окремих фракцій кокосового молока не давало ніяких результатів, тоді як нефракціонований ендосперм викликав поділ клітин.
При приготуванні твердих живильних середовищ для поверхневого вирощування калусних тканин використовують очищений агар-агар - полісахарид, що отримується з морських водоростей.
Середовище Мурасіге і Скуга - найбільш універсальне. Воно придатне для утворення калусів, підтримки неорганізованого калусного росту, індукції морфогенезу у більшості дводольних рослин. Так, зміна співвідношення ауксина і кінетина приводить до утворення або коріння (переважання ауксина), або стеблових культур (переважання кінетина).
Середовище Гамборга і Евелега добре підходить для культивування клітин і тканин бобових рослин і злаків, середовище Уайта забезпечує вкорінення пагонів і нормальний ріст стебла після регенерації, а середовище Ніча і Ніч придатне для індукції морфогенезу в культурі пиляків.
Внесення в живильне середовище аргініну і орнітину підсилює ріст культури коренів беладони Аtrора bеlаdоппа і збільшує в ній вміст алкалоїдів на 60 %. Однак в культурі тканин махорки не спостерігалося збільшення кількості алкалоїдів після внесення в живильне середовище таких попередників біосинтезу, як лізин, орнітин і нікотинова кислота. На кількість і динаміку накопичення, наприклад, тропанових алкалоїдів в суспензійній культурі з листка дурману звичайного впливають не лише попередники (фенілаланін, орнітин), а й стимулятори росту (кокосове молоко, дріжджовий екстракт) та час їх внесення в середовище.
Фізичні чинники. На зростання і розвиток рослинних тканин in vitro великий вплив мають фізичні чинники - світло, температура, аерація, вологість.
Світло. Більшість калусних тканин можуть рости в умовах слабкого освітлення або в темноті, оскільки вони не здатні фотосинтезувати. Разом з тим світло може виступати як чинник, що забезпечує морфогенез і що активує процеси вторинного синтезу.
Таблиця
Склад живильних середовищ, що використовуються при культивуванні клітин і тканин (по Р. Р. Бутенко, 1999)
Компонент середовища Концентрація, мг/л
Мурасіге і Скуга Гамборга і Евелега Уайта Ніча і Ніч
KNO3 1900 3000 81 950
NH4NO3 1650 - - 720
Ca(NO3)2 - - 142 -
Ca(NO3)2•4H2O - - - -
(NH4 )2SO4 - 134 - -
CaCl2•H2O - - - 166
CaCl2•2H2O 440 150 - -
KCl - - 65 -
KH2PO4 170 - 12 68
NaH2PO4•H2O - 150 - -
MnSO4•H2O - 10 - -
MnSO4•4H2O 22,3 - - 25
ZnSO4•4H2O 8,6 - - -
ZnSO4•7H2O - 2 - 10
H3BO4 6,2 3 - 10
CuSO4•5H2O 0,025 0,075 - 0,025
Na2MoO4•2H2O 0,25 0,25 - 0,25
CoCl2•6H2O 0,025 - - -
FeSO4•7H2O 27,8 - - 27,8
NaEDTA•2H2O 37,3 - - 37,3
Секвестрен 330-Fe - 28 - -
Мезоінозит 100 - - 200
Аскорбінова кислота - - - 3
Тіамін-HCl 0,5 3
Піридоксин-HCl 0,5 1
Нікотинова кислота 0,5 -
Сахароза 30000 60000
Агар «Дифко», гельрит, агароза - - - 7000
Як джерело світла використовують люмінесцентні лампи. Для більшості трав'янистих рослин оптимум освітленості складає приблизно 1000 люкс. Дуже низька (300 люкс) або висока (3000- 10 000 люкс) освітленість пригнічує зростання. Освітлення може впливати на метаболізм каллусних клітин. Так, в культурах чайної рослини під дією світла збільшувався біосинтез поліфенолов. Навпаки, в культурі клітин Scopoliaparvi-flora світло пригнічувало утворення алкалоїдів. Окрім ііітенсивності освітленості на культуру тканини і її фізіологічні особливості впливає якість світла. Так, більше 20 флавонів флавонолових глікозидів утворюється в культурах клітин петрушки після освітлення її безперервним люмінесцентним світлом «холодний білий». Разом з тим синтез флавонових глікозидів активується при послідовному опромінюванні ультрафіолетовим світлом, а потім світлом, лежачим в області «красний-длінноволновий червоний».
Синтез антоціанів в культивованих клітинах залежить як від інтенсивності освітлення, так і від його спектральної характеристики. Наприклад, в калусних культурах гаплопапусу утворення антоціану індукується синім і ультрафіолетовим світлом. Однак наявність в середовищі гіберелової кислоти в період освітлення синім світлом повністю пригнічує утворення антоціанів.
Температура. Для більшості калусних культур оптимальна температура 26 °С. В той же час калуси і культури клітин діоскореї дельтовидної добре ростуть навіть при температурі 32°С. На відміну від зростання культур клітин і тканин індукція їх морфогенезу вимагає нижчих температур (18-20°С). Вплив температури на метаболізм клітин in vitro вивчений слабо. Є дані, що в калусних культурах максимальне утворення алкалоїдів спостерігалося при температурі 25°С, а при підвищенні температури різко знижувалося. У суспензійних культурах клітин Ipomoea вміст жирних кислот значно збільшувався, якщо їх вирощували при субоптимальних температурах зростання (15°С). Тому при вирощуванні культури in vitro необхідно ретельно вивчати вплив всіх абіотичних чинників, зокрема температурного, на ріст і метаболізм клітин.
Наприклад, синтез у клітинах флавоноїдів у флоемі експлантів коренеплоду моркви індукується короткочасною обробкою холодом, наслідком чого є утворення яскраво-червоного калусу на середовищі із сахарозою.
Аерація. Для вирощування суспензійних культур велике значення має аерація. Особливо важливе постачання повітрям культивованих клітин у великих об'ємах ферментерів.
При порівнянні різних типів ферментерів було доказано, що синтез вторинних метаболітів в суспензійній культурі був найбільшим при подачі повітря знизу. При вирощуванні клітин в малих об'ємах (у колбах) нормальна аерація досягається при постійному перемішуванні суспензії.
Вологість. Оптимальна вологість в приміщенні, де ростуть культури, повинна складати 60 - 70%.
Таким чином, культивування клітин і тканин залежить від багатьох чинників зовнішнього середовища, і дія їх не завжди чітко відома. Тому при введенні в культуру нового виду рослини необхідно перш за все ретельно вивчити вплив фізичних чинників на ріст і фізіологічні характеристики цієї культури.
МЕТОДИ ПІДВИЩЕННЯ ПРОДУКТИВНОСТІ КУЛЬТУР ТКАНИН ПРОДУЦЕНТІВ БАР
Для підвищення продуктивності культивованих клітин широко і в багатьох випадках успішно застосовують:
клітинну селекцію, що ґрунтується як на спонтанній, так і на індукованій різними мутагенами мінливості культивованих клітин;
оптимізацію умов вирощування і складів ростових і продукційних живильних середовищ;
культивування диференційованих культур, клітин чи індукцію диференціювання; використання еліситорів.
Останнім часом з цією метою застосовують методи генетичної інженерії. Найрезультативнішим є трансформація клітин за допомогою бактерії Аgrоbасtеrіит rhіzоgепеs і отримання так званих бородатих коренів (hairy roots), продуктивність яких значно вища, ніж звичайних недиференційованих культур. Підвищують синтез вторинних метаболітів шляхом підсилення активності відповідного ферменту. Це можливо:
шляхом введення гетерологічного гена з тією самою функцією від мікроорганізмів чи інших видів рослин;
підстановкою власного гена під сильніший промотор;
введенням гена, що кодує ферменти, нечутливі до ретроінгібування, чи гена, що кодує антитіла проти ензиму, що є конкурентом за той же субстрат, що і бажаний ген;
зниження катаболізму цільових вторинних сполук.
Низький рівень біосинтезу вторинних метаболітів в культивованих клітинах зумовив пошук як спонтанних мутацій з підвищеним рівнем біосинтезу цільової речовини, так і застосування методів експериментального мутагенезу. Одними з перших були дослідження здатності культивованих клітин моркви накопичувати каротиноїди, виділено мутантні клітинні клони, що характеризуються пригніченням синтезу хлорофілу і значним підвищенням рівня синтезу каротиноїдів. Зокрема, візуально виділено мутантний клон жовтогарячого кольору який на відміну від звичайної тканини камбіального походження, що накопичує значну кількість хлорофілів а та b і невелику кількість каротинів продукує високий вміст каротинів і ксантофілу і майже повністю позбавлений хлорофілу.
Серед перших робіт із застосуванням мутагенів для отримання більш продуктивних клітинних ліній слід назвати вивчення впливу ультрафіолетового та видимого світла на ріст калюсу, отриманого з пилку гінкго, виділення антоціансинтезуючих клітинних ліній після обробки ультрафіолетом і X-променями, обробку калюсних тканин раувольфії зміїної азотистим іпритом.
Культивування продуктивних клітинних штамів
Калуси рослин і культури клітин культивують у стерильних умовах на спеціальних агаризованих або рідких живильних середовищах у суворо контрольованих умовах. Принциповий підхід полягає в можливості формування первинного калюсу, що започатковує суспензійно-клітинні культури. На цьому рівні звичайно проводять аналіз і добір високопродуктивних ліній клітин, що надалі проходять глибинне культивування у ферментерах. Аналіз культур слід проводити до 3-4-го пасажу. Залежно від культури тривалість одного пасажу може змінюватись від 15 до 45 діб.
Суспензійним культурам надається перевага внаслідок їх більшої морфологічної, біохімічної, генетичної вирівняності й прискореного росту. Час, потрібний для росту клітинної суспензії, дорівнює 14—20 діб. Добором швидкоростучих фракцій можна скоротити тривалість культивування до 8—12 діб.
Здатність синтезувати визначені вторинні продукти часто пов'язана з диференціюванням клітин. Наприклад, регенерація коренів є істотним під час виробництва ароматичних олій у культурах тканин цибулі, у той час як диференціювання бруньок бажане у разі біосинтезу дигітоксину.
Диференційовані культури тканин поділяють на культури коренів, бруньок, листків і соматичних зародків. Ступінь диференціації в цих групах змінюється від справжнього калюсу до формування цілого органа. Це означає, що конструювання нових біореакторів може виявитися вкрай потрібним для здійснення масштабного культивування і виробництва вторинних метаболітів із цілком або частково диференційованих тканин. У такому разі вважається, що витрати, пов'язані з одержанням продукту, можуть зменшитися за рахунок введення в технологічний процес дешевих вуглеводних джерел (наприклад, патоки), а також вуглекислого газу, індукції виділення продукту в середовище, напівстерильне вирощування і підвищення виходу продукту з використанням біокаталізу.
У визначенні продуктивності клітинних штамів, оптимізації їх росту і генетичної стабільності провідне місце належить живильним середовищам. їхніми найважливішими компонентами є фітогормони. Від балансу ауксинів і цитокінінів, що є основними фітогормональними компонентами, значною мірою залежить спроможність культур синтезувати цей метаболіт. Універсальних рецептів оптимізації середовища немає, але відомо що в багатьох культурах наявність 2,4-Д пригнічує вторинний метаболізм. Видалення або заміна її на інші ауксини або ауксиноподібні компоненти відновлює синтез вторинного метаболіту.
Не менш важливими елементами є вуглець, азот і фосфор. З усіх використовуваних вуглеводних джерел, таких, як сахароза, глюкоза, фруктоза, мальтоза, лактоза, рафіноза, сорбітол, крохмаль, сироватка, патока тощо, глюкоза і сахароза є найвживанішими субстратами, хоч у деяких випадках не найефективнішими.
З випробуваних джерел азоту, таких, як нітрати, сечовина, глутамін, гідролізат казеїну і суміш амінокислот, найприйнятнішими для культур клітин рослин виявилися нітратна й аміачна форми азоту. Фосфор звичайно використовують у формі дигідрофосфату калію (КН2Р04).
Селекція високопродуктивних клітинних штамів
З метою підвищення продуктивності клітинних культур використовують різні методи селекції.
Ступінчаста селекція. Стабільні високопродуктивні клони одержують багатократним добором калюсних або суспензійних культур на спеціальних середовищах з поступовим збільшенням концентрації селективного фактора. Таким чином вдалось збільшити, наприклад, кількість аймаліну в клітинах раувольфії у 3—4 рази.
Одноклітинні клони. Застосовують мікробіологічні методи клонування з використанням суспензійних культур одноклітинного походження або культури протопластів. Цей прийом ґрунтується на поліморфізмі за спроможністю вихідних клітин синтезувати вторинні продукти. Міні-колонії, що відрізняються вищим накопиченням відповідного вторинного продукту, відбираються візуально, якщо продукт забарвлений (як у шиконіну) або методом ЕLISА, якщо продукт незабарвлений. Так, добором пігментних колоній горобинника червонокореневого отримано лінії із вмістом шиконіну в 25 разів більшим, ніж у вихідного штаму.
Клітинний мутагенез. Ступінь мінливості вихідних клітинних клонів за здатністю синтезувати вторинні біопродукти збільшують з використанням хімічних або фізичних мутагенів. У такий спосіб отримано високопродуктивні штами раувольфії зміїної, діоскореї, стефанії та інших культур.
Соматична гібридизація. Злиття протопластів передбачає нові можливості поліпшення і розширення спектра клітинних ліній, спроможних накопичувати кілька вторинних продуктів або продуктів, невідомих раніше. Це залежить від ядерно-цитоплазматичної взаємодії, що виникає лише під час соматичної гібридизації. Отже, дві лінії клітин, кожна з яких має високий рівень різноманітних ключових ферментів, можуть після злиття значно підвищити продуктивність.
Генетична інженерія. Це один із найефективніших методів одержання високопродуктивних клонів шляхом внесення у клітину чужорідної інформації.
Індукція вторинного метаболізму в культурі клітин рослин. Деякі мікроорганізми або продукти їх життєдіяльності під час спільного культивування з клітинами рослин стимулюють синтез вторинних метаболітів. Цей процес відомий як «еліситація» і є відповіддю рослинних клітин на спільне культивування, оскільки пошкодження рослин патогенами призводить до синтезу вторинних продуктів з антимікробними властивостями.
Кріоконсервування елітних клітинних ліній. З практичного погляду важливо, щоб високопродуктивні лінії клітин були збережені протягом тривалого часу без зміни їх здатності синтезувати вторинні продукти. Цього досягають методами кріозберігання. Високопродуктивні культури клітин зберігають синтезуючу здатність після кріогенного зберігання протягом кількох років. Цей метод особливо важливий для нестабільних ліній клітин, що у такий спосіб можуть періодично використовуватись з промисловою метою.
ПРОМИСЛОВЕ КУЛЬТИВУВАННЯ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН
ОСНОВНІ ПРОЦЕСИ КУЛЬТИВУВАННЯ КЛІТИН ЯК БІОПРОДУЦЕНТІВ
Промислове вирощування клітинних культур рослин складається з двох основних етапів - ферментерного і постферментерного. На ферментерному етапі клітини рослин із певною щільністю культивують в біореакторах, при цьому продукт акумулюється в клітині або виділяється у середовище. Потім, на заключному етапі, продукт виділяється із клітин або середовища за допомогою операцій, що не відрізняються від таких у разі одержання мікробіологічних продуктів. Основна мета — очищення продукту до бажаного ступеня чистоти і його підготовка до подальшого використання.
Від ферментерного процесу значною мірою залежить накопичення продукту. Вибір належної схеми для виробництва цього рослинного метаболіту визначають співвідношенням кінетики формування вторинного метаболіту і інтенсивності росту клітин. Для більшої частини культур клітин рослин надійнішим є двохетапне глибинне культивування, тобто динаміка акумулювання активного вторинного продукту не пов'язана з динамікою росту.
Двох етапне культивування полягає в тому, що в першому етапі накопичується біомаса (активний поділ і ріст клітин), другому — вторинні метаболіти, як правило, за відсутності росту. Умови вирощування, зокрема склад живильного середовища, у цих етапах є зазвичай різними.
Оптимізація ферментерного процесу значною мірою залежить від таких складових, як температура, склад живильних середовищ, інтенсивність і спектральний склад світла, рівень попередників синтезованого продукту, наявність інгібіторів метаболізму, фітогормонів, макро- і мікроелементів. На відміну від добре вивчених процесів, що відбуваються у мікроорганізмах і призводять до синтезу відповідних вторинних метаболітів, в ензимології і біохімії культивованих рослинних клітин усе ще існують неточності. Тому оптимізацію умов синтезу вторинних продуктів проводять в основному на емпіричній основі.
Залежно від мети культивування, сировини, продуцента, ступеня вивченості процесу можливі різні варіанти реалізації процесів біосинтезу в промисловій біотехнології.
Біотехнологічні процеси у виробництві розрізняють за :
типом апаратів;
способом подачі поживних речовин і добору отриманих продуктів ;
фізичним станом речовин у ферментері тощо.
Залежно від умов і способів вирощування культивованих клітин існує три основних типи процесів їх культивування.
1.Періодичний процес — одночасно завантажуються всі компоненти живильного середовища і культура продуцентів на початку процесу. Через певний час апарат повністю розвантажують.
Характерні ознаки: безперервна зміна фізіологічного стану клітин і складу середовища, пов'язані з життєдіяльністю продуцентів.
Напівперіодичний процес відрізняється від періодичного тим, що в ньому речовини, потрібні для росту і розвитку продуцентів, додаються в апарат в процесі культивування, апарат розвантажують одночасно.
Безперервний процес характеризується тим, що поживні речовини додаються в апарат; а культуральна рідина, збагачена цільовим продуктом, безперервно вилучається; концентрація біомаси, субстратів, швидкість росту продуцентів та інші параметри сталі.
Синтез вторинних метаболітов
Нині виробництво БАР із культури тканин здійснюють двома способами ферментації: культивуванням на поверхні твердого середовища (твердофазна ферментація) і зануреним глибинним культивуванням (суспензійне культивування) .
Розвиток організму - продуцента БАР у ферментаторах.
Процес розвитку організму-продуцента БАР у ферментаторах проходить за умови суворого контролю всіх стадій, дуже точного виконання розробленого регламенту умов нагромадження БАР. Велика увага приділяється підтримці заданої температури культивування, активної кислотності середовища рН, ступеня аерації і швидкості роботи мішалки. З огляду на споживання організмом основних поживних компонентів субстрату (джерела вуглеводу, азоту, калію, магнію, фосфору, амінокислот, вітамінів) контролюється утворення БАР.
Біореактори
Тип біореакторів має особливе значення у разі виробництва біологічно активних речовин. Доведено, що біореактори, розроблені для мікроорганізмів, не придатні для клітин рослин, тому що механічне перемішування спричинює швидке руйнування клітин і порушує стерильність клітинної культури. Це призвело до потреби конструювання аероліфтних ферментерів з контрольованою подачею повітря. Клітини в них не руйнуються й інфікуються значно менше. Крім того, витрачається менше енергії внаслідок відсутності механічного перемішування клітин. Цей тип реакторів вдосконалюється і знаходиться в прямій залежності від розробок нових технологій, якими є іммобілізовані системи.
Особливу увагу під час розвитку продуцента у ферментаторах звертають на процес піногасіння. При продуванні повітря через організм - продуцент БАР часто відбувається густе ціноутворення, що суттєво порушує проходження всього процесу розвитку штаму - продуцента БАР у ферментаторі. Основна причина появи великої кількості піни - висока в'язкість живильного середовища, обумовлена сильним нагромадженням біомаси.
Для боротьби з піною у ферментаторах при одержанні біомаси використовують різні поверхнево-активні речовини: рослинні олії (соєву, соняшникову), мінеральні масла (вазелінове, парафінове), спирти і жирні кислоти. Нерідко як піногасники використовують спеціальні синтезовані речовини (силікони, діазобуталкарбоміл та інші сполуки).
Вирощування тканини проводять протягом 70 діб. У цей період здійснюють мікробіологічний, біохімічний і візуальний контроль. Візуальний контроль проводять не рідше одного разу в 10 днів - відбраковують інфіковані тканини.
Дуже великий вплив на ріс суспензійного середовища має його безперервне перемішування, яке забезпечує хорошу аерацію і запобігає осадженню клітин. У лабораторних умовах перемішування досягається завдяки використанню гойдалок або ролерних установок. При промисловому вирощуванні суспензійних культур застосовують спеціальні системи, в яких йдуть збільшення біомаси і синтез вторинних з'єднань, - біореактори. Ці системи володіють важливими перевагами: можливістю управляти процесом культивування на основі показників датчиків; крім того, великий об'єм культивованого матеріалу дозволяє забирати значні проби, при цьому стресові реакції у культури клітин не виникають. Залежно від способу перемішування культуральної рідини біореактори ділять на дві групи.
Перша група включає біореактори, в яких суспензійна культура перемішується тільки за рахунок подачі повітря; у другій групі біореакторів культура перемішується механічним способом (мал. 6.6).
Вирощування культур рослинних клітин в біореакторах проводять в двох режимах. Перший режим - періодичне культивування- полягає в тому, що після закінчення процесу відкачують і використовують всю суспензію клітин. При другому режимі - проточне культивування - в біореактор постійно додають свіже живильне середовище і одночасно відбирають той же об'єм або суспензії (відкрите проточне культивування), або одного відпрацьованого поживного середовища, залишаючи клітини в реакторі (закрите проточне культивування).

Мал. 6.6. Схема роботи основних типів біореакторів:
1 - біореактор з механічним перемішуючим пристроєм; 2 - барботажний біореактор; 3 - аероліфтний біореактор; 4 - біореактор з винесеною циркуляційною петлею
Існують два різновиди відкритого культивування. Перша - турбідостат - має на увазі вимірювання і автоматичну підтримку концентрації клітинної біомаси в реакторі на одному рівні шляхом зміни швидкості потоку. Другий різновид - хемостат - полягає в подачі в біореактор з постійною швидкістю поживного розчину при одночасному відкачуванні з тією ж швидкістю клітинної суспензії.
Існує ще одна сучасна технологія отримання вторинних метаболітів за допомогою імобілізованих клітин культури, тобто розміщення їх на певному носію або адсорбція в ньому. Носій з клітинами поміщають в живильне середовище. Клітини залишаються живими. Вони припиняють ріст, але продовжують синтез метаболітов, виділяючи їх в середовище.
Твердофазний спосіб культивування
У наш час рослинні клітини культивують, як правило у вигляді калуса. Калусні клітини одержують із фрагментів тканин різних органів вищих рослин, поміщаючи шматочки такої тканини в живильне середовище (в пробірках, колбах, на чашках Петрі). Через 4-6 тижнів культивування трансплантанту виникає первинний калус, який необхідно перенести на свіже живильне середовище з розрахунку шматочок калусу вагою 60-100 мг на 30-40 мл свіжого середовища. Калусна тканина, що виросла на поверхні твердого живильного , середовища має аморфну структуру, що представляє собою масу тонкостінних паренхімних клітин. При тривалому пересадженні калусні тканини, що мають первісну білу, жовтувату, зелену або червону пігментацію, можуть втрачати забарвлення, а структура тканини стає більш пухкою. Хімічний склад калусної тканини звичайно відрізняється від складу відповідного органу рослини (табл. 9.2)
Таблиця 9.2
Хімічний склад (%) біомаси культури тканини й кореня женьшеню
Склад Біомаса культури тканини Корінь
Азот загальний 4,82 2,73
Білковий 1,18 1,68
Ліпіди 1,61 2,34
речовини, Що Редукують 2,38 -
Сахароза 1,08 -
Крохмаль 5,40 3,07
Гемицеллюлоза 4,46 6,03
Пектинові речовини 9,84 10,27
Панаксозиды (А + G) 3,31 3,12
Калусні клітини після ряду поділів переходять на звичайний для даної рослини цикл розвитку, тобто починається диференціація. Цей процес регулюють гормони.
Культивування клітин рослин на твердих середовищах можна здійснювати у механізованих установках. Схема однієї із сучасних установок конструкції ВНІІбіотехніка для твердофазного культивування представлена на мал. 9.1. Апарат являє собою вертикальну посудину циліндричної форми з конічним днищем, обладнаний сорочкою й змійовиками для охолодження культури. Усередині він розділений перфорованими пластинами. Субстрат перемішується за допомогою лопатевих мішалок, встановлених у кожній секції на вертикальному валу. Засіяне живильне середовище завантажують через верхній люк, а готову культуру вивантажують через нижній.
Культура подається з верхніх секцій на нижні шляхом періодичного перекидання перфорованих пластин на 900 навколо горизонтальної осі. У кожну секцію під перфоровані пластини надходить стерильне повітря.
Перемішування субстрату в даному апараті дозволяє вести процес культивування клітин у товстому шарі субстрату (300-500 мм) при вирощуванні в кюветах - 20-30мм. Це істотно підвищує питому продуктивність установки.
Рис. 1. Схема апарата конструкції ВНДІ-біотехніка для поверхневого вирощування продуктів біосинтезу:
1 — люк для вивантаження; 2 — валик секції; З — опора; 4 — колектор стерильного повітря; 5 — змійовик; в — лопать мішалки; 7 — колектор відпрацьованого повітря; 8 — кришка; 9 — бобишка манометра; 10 — штуцер; 11 — повітряний клапан; 12 — шестерня приводу вала; 13 — вал; 14 — люк для завантаження
Процес одержання культури клітин твердофазним способом вимагає використання занадто великої площі, не гарантує стерильності й дає низький вихід продукту.
Глибинне суспензійне культивування
Для суспензійного культивування необхідно одержати лінії клітин, що утворять невеликі агрегати (по 5-10 клітин) Для цього більш придатні пухкі калусні тканини. Трансплантант бажано обробляти пектиназою. Рекомендується використовувати середовища, що містять 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту і не містять іони Са. У таких середовищах агрегати клітин не утворюються. Перед пересіванням первинну культуру фільтрують через два шари марлі або через сита (нейлонові, металеві), щоб відокремити великі агрегати калусної тканини й залишки трансплантанта. На утворення клітинних агрегатів також впливає інтенсивність перемішування середовища, тому що клітини надзвичайно чутливі й швидко лізуються. Більшість клітин гине.
Глибинне культивування можна здійснювати в колбах на кочалках при частоті обертання 100-120 об/хв.
На 60-100 мл середовища беруть 2-3 мл свіжої калусної тканини. Для культивування рослинних клітин використовують також спеціальні металеві або скляні ферментатори різної конструкції (з мішалками або барботажного типу). Режим ферментації періодичний або безперервний, головним чином хемостатний.
Біосинтез проводять в апараті об’ємом від 0,1 до 63м3.і більше (мал. 9.2).
При керуванні процесом вирощування клітин важливо мати гомогенну систему.
Аерацію культуральної біомаси здійснюють стерильним повітрям через барботер. Повітря стерилізують, як правило, шляхом фільтрації на двох-трьох послідовно встановлених фільтрах. У ході культивування клітин рослин регулюють температуру (25-37 0С), рН і окислювально-відновний потенціал.
Процес культивування ведуть доти, поки йде інтенсивний синтез цільового продукту й поки в середовищі не будуть вичерпані поживні речовини. При визначенні кінця культивування необхідно враховувати дані мікроскопічного контролю стану культури, відсутність сторонньої мікрофлори, концентрацію основних поживних речовин, біомаси, цільового продукту, рН.

Рис. 2. Схема ферментатора з комбінованим підведенням енергії для глибинного культивування
1 - вал; 2, 3, 6 - мішалки; 4 - статор; 5 - барботер
Необхідно відзначити, що рослинні клітини ростуть і розмножуються значно повільніше, ніж клітини мікроорганізмів. Час їхнього подвоєння 1-3 доби. Процес культивування рослинних клітин займає 2-3 тижні, що підвищує вимоги до забезпечення асептичних умов.
У наш час методом культивування клітин у промислових умовах одержують речовини вторинного метаболізму. Практичний інтерес представляють алкалоїди, глікозиди, полісахариди, терпеноїди, поліфеноли, ефірні масла, пігменти й ін. Деякі вторинні метаболіти, одержувані при культивуванні рослинних клітин перераховані в табл. 9.3.
Таблиця 9.3
Продукти вторинного метаболізму, одержані при культивуванні
рослинних клітин
Продукт Застосування
Вінбластин або вінкристин Лікування лейкемії
Дигітин Лікування серцево-судинних захворювань
Хінін Лікування малярії
Кодеїн Аналептик
Аймалін Противоаритмічний
Як у будь-якому біотехнологічному процесі при одержанні метаболітів за допомогою клітин рослинного походження, важливе значення має активність продуцента. Останні досягнення клітинної інженерії показали, що в ряді випадків метаболіти, які активно продукують рослинні клітини, можна одержати методом злиття протопластів двох вихідних рослинних клітин. При цьому гібридні клітини продукують не тільки метаболіти вихідних рослин, але й зовсім інші. Гібридизацію рослинних протопластів успішно здійснюють методом електростимуляції злиття клітин або прямим мікроіньєкціонуваням ДНК однієї клітини в іншу. Ямомото одержав таким чином гібридні клітини з Coptus japonica (копті японська) й Euphorbia millii молочай Міля (терновий вінець), які активно продукують алкалоїд берберин - антибактеріальні й протитифозні речовини. Концентрація берберину в культуральній рідині досягає 1,39 г/л.
Іммобілізовані системи клітин
Під час оцінки схем для виробництва біологічно активних речовин важливо знати, що синтез вторинного продукту клітин рослин не завжди збільшується паралельно з виробництвом біомаси і що умови сприяння швидкому росту часто пригнічують метаболізм і накопичення продуктів. У такій ситуації найприйнятнішим методом є іммобілізація культури клітин. Цим методом клітини, що знаходяться в пізній стаціонарній фазі, вводяться в належний матрикс і використовують для виробництва метаболітів завдяки процесу безупинного потоку. Основні переваги іммобілізованих клітин рослин:
культивування іммобілізованих клітин дає змогу здійснити оптимальне накопичення продуктів поза клітинами без порушення їх росту; це досягається шляхом розділення функцій росту і біосинтезу вторинних метаболітів;
незважаючи на те що повільний ріст є недоліком використання клітин рослин у процесі культивування суспензій, цей фактор позитивний у системі іммобілізованих клітин; успіх іммобілізованих клітин полягає в культивуванні метаболічно активної популяції клітин, що діляться повільно або зовсім не діляться, для каталізу багатофазних і багатоферментних перетворень; встановлено, що рослинні клітини можуть залишатись життєздатними без клітинного поділу протягом значного часу;
процес іммобілізації дає змогу виділяти синтезований продукт безпосередньо з розчину. Це виключає деякі етапи екстрагування і виділення цього продукту, а також забезпечується безупинне виділення інгібіторів метаболізму;
за іммобілізації збільшується щільність культивованих клітин, що підвищує вихід синтезованого продукту;
утворення агрегатів клітин, характерне для суспензійних культур, звичайно негативно позначається на синтезі вторинних продуктів; у іммобілізованих системах таке утворення потрібне і воно може змінюватись залежно від умов і виду рослин;
на відміну від суспензійних культур, у яких мікробіологічне забруднення створює значні труднощі у промисловому виробництві, в іммобілізованих системах завдяки виділенню клітин із середовища ця вада неістотна;
додавання деяких фітогормонів у живильні середовища протягом тривалого часу може призвести до пригнічення вторинного метаболізму; цей процес у біореакторах для іммобілізованих клітин можна контролювати.
БІОСИНТЕЗ БАР
Стадія біосинтезу - основна біологічна стадія процесу одержання БАР із культури тканин.
Завдання цієї стадії - забезпечення для продуцента БАР таких умов розвитку, які б сприяли максимальному рівню біосинтезу БАР. Ефективність стадії біосинтезу залежить від рівня утворення БАР із культури тканини і визначається генетичними особливостями організму, складом живильного середовища, режимом розвитку продуцента. Вона також залежить від часу максимального утворення БАР, вартості компонентів середовища, піногасників і енергетичних витрат, пов'язаних із процесом розвитку організму - продуцента БАР.
ПОПЕРЕДНЯ ОБРОБКА БІОМАСИ
У процесі розвитку організму - продуцента БАР ці речовини майже повністю виділяються з клітин у навколишнє середовище. Однак у деяких випадках лише частина БАР виділяється в культуральне середовище, а інша частина зберігається усередині клітин. У деяких продуцентах БАР вони майже повністю містяться в клітинах організму.
Залежно від того, де антибіотична речовина зосереджена, застосовують відповідні методи її екстракції.
При твердофазному способі культивування з колби місткістю 0,25 л із добре вирощеної культурної тканини спочатку знімають сиру біомасу, потім сушать біомасу на листах при температурі 58±2 °С. Час сушки біомаси залежить: від початкової вологості біомаси; товщини шару біомаси; температури сушки.
Закінчення процесу сушки визначають на дотик. Не повинно бути м'яких вологих грудок. Суха маса повинна мати забарвлення від жовтого до коричневого кольору, має бути пухкою, легко розсипатися при продавлюванні між пальцями. Залишкова вологість біомаси після сушки - не більше 12 %. Потім суху біомасу подають на стадію виділення та очищення БАР з аналітичним паспортом на вміст БАР.
При глибинному культивуванні, якщо БАР знаходиться в культуральній рідині, її виділяють методами екстракції розчинниками, які не змішуються з рідкою фазою, або осаджують у вигляді нерозчинної сполуки, або сорбують іонообмінними смолами.
Виділення БАР із клітин організму-продуцента здійснюють за допомогою екстракції органічними розчинниками. Якщо БАР містяться в культуральній рідині та в клітинах продуцента, первинною операцією їх виділення є переведення у фазу, з якої найбільш доцільно їх ізолювати. Для цього БАР, яка міститься в культуральніи рідині і в клітинах продуцента, переводять в осад, а потім її екстрагують.
Відділення нативного розчину від біомаси і завислих частинок проводять методами фільтрації або центрифугування.
Для процесу фільтрації використовують різні фільтрувальні апарати: фільтрпрес, нутч-, друк-фільтри, центрифуги, сепаратори.
Фільтрпреси використовують для обробки великих об'ємів культуральної рідини. Ці апарати складаються із плит і рам, що чергуються, і фільтрувальних перегородок між ними. Процес фільтрації здійснюється під тиском. Для фільтрації невеликих об'ємів культуральної рідини звичайно використовують нутч-, друк-фільтри. Перший апарат працює під вакуумом, другий - в умовах підвищеного тиску над рідиною, що фільтрується.
Для одержання рідини, звільненої від завислих частинок, найбільшого поширення набув метод центрифугування. Хороші результати досягаються при правильному виборі швидкості подачі рідини (кращий варіант - 15 000 об/хв).
Відділення міцелію або інших завислих частинок може також відбуватися в сепараторах. При швидкості обертання барабана, яка дорівнює 7000-7500 об/хв, завдяки відцентровій силі тверді частинки спрямовуються до стінок барабану, де й осаджуються, а відсепарована рідина спрямовується до центра барабана і піднімається в спеціальні камери.
ВИДІЛЕННЯ ТА ОЧИЩЕННЯ БАР
У процесі утворення БАР у біомасі (твердофазний спосіб культивування) і в культуральній рідині (глибинний спосіб культивування) разом із різними невикористаними компонентами середовища виділяються і різноманітні продукти обміну, продукти автолізу клітин. Видалення домішок - перша і дуже важлива стадія хімічного очищення БАР.
Стадія виділення і хімічного очищення включає низку процесів: від обробки нативного розчину до висушування готового очищеного препарату. На цій стадії, залежно від властивостей БАР, їх хімічної будови і місця основного накопичення застосовують різні методи виділення та очищення. Як основні методи застосовують екстракцію в системах рідина-рідина, екстракцію осадження, сорбцію на різних сорбційних матеріалах, мембранні методи очищення, кристалізацію, упарювання, висушування.
Однією з особливостей стадії виділення і очищення є те, що під час виділення БАР доводиться працювати з дуже невисокими концентраціями речовин, що виділяються, (не перевищують 2 %).
Наприкінці стадії очищення вже мають справу з більш високими концентраціями БАР, які досягають 20-30 %.
Мета очищення - витягування БАР із нативної рідини або з клітин продуцента, їх концентрування і звільнення (власне очищення) від супутніх домішок і нарешті одержання добре очищеного препарату, придатного для відповідного застосування.
БАР рослинного походження у деяких випадках під дією жорстких зовнішніх чинників (підвищеної температури, високої кислотності або лужності і т. ін.) втрачають свої властивості; інактивуються. Тому їх виділення та очищення необхідно проводити дуже обережно.
Способи очищення біологічно активних речовин (БАР) рослинного, тваринного походження, отриманих на основі біосинтезу.
На стадії очищення видалення культуральні рідини піддають послідовній обробці, метою якої є виділення комплексу діючих речовин в нативному стані або індивідуальних БАР, вільних від супутніх речовин. Прийоми і способи очищення БАР дуже різноманітні і індивідуальні. Необхідність застосування конкретного методу залежить від початкових властивостей видалення або культуральної рідини (в'язкості, концентрації продукту, наявності домішок і небажаних нерозчинних речовин), а також від необхідного ступеня чистоти і кінцевої форми продукту (кристалічна речовина, його концентрований розчин, висушений порошок і т. д.). Неочищений продукт можна виділити, наприклад, шляхом упарювання видалення або культуральної рідини після екстрагування.
Послідовність стадій очищення при отриманні високо-очищенних БАР виглядає таким чином:
Відділення нерозчинних речовин. Для цієї мети звичайно використовують фільтрування, центрифугування, відстоювання, седиментацію і декантацію.
Очищення БАР. На стадії очищення БАР звичайно відбувається відділення домішок, а також подальша концентрація продукту. У такому випадку найчастіше використовують фракційне осадження, екстракцію в системах рідина-рідина, розділення за допомогою мембран, різні сорбційно-хроматографічні методи.
Остаточне очищення БАР. В рамках такої технології звичайно застосовують центрифугування, кристалізацію, сушку розпиленням, ліофілізацією (вимерзанням) або відгонку органічного розчинника.
Методи осадження БАР із розчинів.
Осадження білків, камеді, слизів, пектинів з водних розчинів засноване на зміні їх розчинності при додаванні значних кількостей певних речовин. Так, при додаванні у витяжку розчину електроліту, утворені іони електроліту гід ратуються, зневоднюючи молекули біополімеру. При цьому зникає захисний гідратний шар молекул, спостерігається злипання частинок і осадження біополімеру. Висолювання дуже широко застосовується для очищення білкових гормонів (гіпофіза, підшлункової, щитовидної і паращитовидних залоз), стероїдних гормонів, ферментів слизистої оболонки шлунку і підшлункової залози, продуктів біосинтезу, простагландинів з плазми крові людини.
Необхідно враховувати і той факт, що різні солі володіють різними висолюючими властивостями. Ще в 1389 р. Гофмейстер відзначив, що найбільш ефективно білки осідають у присутності солей з багаторозрядними аніонами й катіонами. Ряди іонів Гофмейстера (або ліотропні ряди), в яких іони розташовані приблизно у порядку зменшення висолюючої здатності, виглядають таким чином:
Аніони: цитрат, тартрат,

Катіони:
Для осадження високомолекулярних з'єднань найчастіше застосовують добре розчинні у водних середовищах сульфат амонію і хлорид натрію, хоча ряди Гофмейстера показують, що для отих цілей можна використовувати і інші солі.
Відоме застосування для осадження БАР і флотоагентів (толуол), рідких (парафін і ін.). Серед реагентів, здатних специфічно зв’язувати і осаджувати, наприклад ферменти, значну роль відіграють розчинні синтетичні або природні полімери і поліелектроліти. При отриманні ферментів, зокрема гідролаз, з культуральних рідин рекомендовано використовувати танін і білкові добавки — желатин, казеїн, сироватку, пектон або желатозу з додаванням таніну.
Осадження біополімерів здійснюють і органічними розчинниками (спирт, ацетон), що проводиться при охолоджуванні — один з розповсюджених способів концентрації розчинів, що містять білки, слизи, пектини.
Він має ряд переваг перед висолюванням, зокрема можливість регенерації, що позитивно відображається на економічних показниках технологічного процесу. Проте органічні розчинники не володіють здатністю осадження білків і інших біополімерів.
При виборі конкретного методу осадження необхідно враховувати не тільки ступінь збагачення і витрати на осадження, але і необхідний ступінь чистоти біополімеру.
Відомо, що осадження білка залежить від ряду чинників, що впливають на їх розчинність, в основному від величини рН, і концентрації розчину. Найменша розчинність спостерігається при рН, рівному рl, величині, специфічній для кожного індивідуального білка. Оскільки при рl результуючий заряд молекули білка рівний нулю, а при інших значеннях рН молекули білка мають той або інший заряд, то сили електростатичного відштовхування між молекулами розчиненої речовини мінімільні при рl. Такий механізм припускає можливість розділення білків з різними ізоелектричними крапками шляхом фракційного осадження; при даному рН осідатимуть білки, рl яких найбільш близьке цьому рН (якщо інші характеристики білків, наприклад молекулярна маса, близькі).
Шляхом зміни рН складну суміш білків розділяють на фракції, що містять різні білки.
В той же час багато білок при дуже високих або дуже низьких значеннях рН можуть денатуруватися. З цієї причини найчастіше застосовують інший метод осадження — висолювання.
Розділення БАР за допомогою мембран.
В даний час в хіміко-фармацевтичній і мікробіологічній промисловості все більш широко одержують складні термічно і хімічно лабільні органічні сполуки. Потрібні «м'які» умови виробництва, яким в значній мірі відповідають мембранні процеси. Впровадження мембранних процесів дозволяє інтенсифікувати технологію концентрації біологічно активних речовин, скорочуючи при цьому втрати їх активності. Мембранні методи розділення сумішей, що містять біополімери, значно підвищують якість продукції.
Основою розробки сучасних економічних мембранних процесів є отримання і подальше удосконалення високоселективних ацетатцелюлозних і синтетичних мембран. Так, за останні 20 років, що пройшли з часу отримання мембран з ацетату целюлози, їх проникність вдалося збільшити приблизно в 100 разів.
У країнах СНД набули поширення ацетатцелюлозні мембрани «Владипор», «Міфил» і синтетичні напівпроникні мембрани — з сополімеру вінілпіролідону з метилметакрилатом.
За кордоном широко застосовують мембрани фірм «Абкор», «Мілліпор» (США), «Шляйхер Шуель», «Сарторіус» (Німеччина), «Амікон» (Голландія), «Нуклеопор» (Великобританія), комплексні системи ДДС-РО (Данія) для ультрафільтрації і концентрації (зворотній осмос), виготовлені на основі нейлону, полівінілхлориду, тефлону, ацетату нітроцелюлози. Вони мають високу пористість (84%), хімічно стійкі і біологічно нейтральні.
В даний час розробляються установки періодичної і неперервної дії з використанням апаратів плоскорамного, рулонного, трубчастого типів, а також із застосуванням волокон. Також розширюється промислове виробництво мембранних фільтрів з можливістю виділення досить малих частинок: 10—0,2 мкм — при мікрофільтрації; 0,02—0,001 мкм — при ультрафільтрації; до 0,0001 мкм — при гіперфільтрації (зворотній осмос).
Всі мембранні фільтри повинні працювати в умовах широкого інтервалу температур (0—60 °С), рН (3,0—11,0). При проведенні мембранної фільтрації необхідно враховувати градієнт електричного потенціалу, концентрацію або тиск.
Серед рідинно фазових мембранних процесів розрізняють діаліз, електродіаліз, ультрафільтрацію, зворотній осмос.
Діаліз і електродіаліз.
Явища діалізу і електродіалізу знаходять застосування при очищенні рослинних витяжок. Діаліз заснований на властивостях молекул біополімерів, що мають великі розміри, не проходити через напівпроникні мембрани, тоді як речовини з меншими розмірами молекул проходять через них досить вільно. Для діалізу використовують плівки желатину, целофану, колодія, нітроцелюлози. Процес діалізу протікає звичайно досить повільно, він прискорюється при підвищенні температури, збільшенні площі діалізу і прикладанні електричного струму. У останньому випадку спостерігається явище електродіалізу, якому підпорядковані в основному речовини, що розпадаються на іони.
Проста установка для електродіалізу складається з ванни, розділеної двома напівпроникними перегородками на три відсіки. У крайні відсіки опущені катод і анод, в середній відсік наливається діалізуєма витяжка. Катіони під дією електричного струму рухаються через напівпроникні перегородки до анода, аніони — до катода. У середньому відсіку залишаються речовини, які не проходять через напівпроникні перегородки. В процесі роботи періодично або безперервно виробляється відведення витяжки, розчинів продіалізованої речовини.
Електродіаліз з іонообмінними мембранами до теперішнього часу не знайшов широкого застосування. Є лише дослідження, які доказують можливість очищення технічних напівпродуктів, що містять алкалоїди гіосциамін і сальсолин від високомолекулярних неіонізованих речовин методом електродіалізу з гетерогенними мембранами МК-40 і гомогенними мембранами МК-1СС.
Дослідження також показали, що перетворення катіонітових мембран, що відбувається в процесі електродіалізу, у форму органічного іона супроводжується стисненням іонообмінних частинок гетерогенних мембран, порушенням їх зв'язку з не набряклою основою мембран і рівномірним стисненням всієї гомогенної мембрани. У першому випадку це приводить до мікродеструкції мембрани і до значного збільшення перенесення розчинника разом з недосоциїрованими з'єднаннями, що обмежує можливості очистки. У разі застосування гомогенних мембран мікродеструкції при переході у форму органічного іона не відбувається, тому гомогенні мембрани більш перспективні для застосування в процесі розділення природних полярних і неполярних органічних речовин.

Ультрафільтрація.
Метод ультрафільтрації полягає в розділенні високомолекулярних і низькомолекулярних з'єднань на селективних мембранах, здатних пропускати низькомолекулярні з'єднання під дією давлення 1—5 кг/см2. Ультрафільтрація в 50— 20 разів ефективніша фільтрації гелю і в 1000 разів ефективніша очищення з використанням фракціонування етанолом. Застосування ультрафільтрації має ще ряд переваг: виключається денатурація білка, оскільки процес йде без фазових перетворень при будь-якій температурі; можлива одночасна концентрація і очищення від мінеральних і низькомолекулярних органічних речовин; незначні витрати енергії. Ультрафильтраціонні установки відрізняються простою конструкцією і експлуатацією.
Недоліком ультрафільтрації є емпіричний підхід до підбору мембран на певній стадії виділення БАР. Теоретично пророчити ультрафільтраційні властивості розчинів складного складу неможливо, оскільки мембрани звичайно стандартизують кислими речовинами з певною молекуляр- ною масою. Випускають ультрафільтраційні ацетатцелюлозні мембрани: УАМ 50м, УАМ 100м, УАМ 150м, УАМ 200м, УАМ 300м, УАМ 500м.
Технологія ультрафільтрації наступна: суспензію під тиском пропускають через напівпроникну мембрану з великою кількістю пор найдрібнішого діаметру (0,02 — 0,001 мкм), внаслідок чого колоїдні частинки затримуються мембраною, а вода і що містяться в ній молекули проходять крізь стінки ниток і накопичуються в корпусі патрона. Навіть при низькому тиску забезпечується інтенсивний потік фільтрату. Активна частина мембрани — це поверхня, по якій проходить суспензія. Розділення фракцій відбувається саме на цій тонкій поверхні. Мембрана неоднорідна по товщині, внаслідок чого опір перебігу рідини по всій її поверхні мінімальний.
Основні виробники ультрафільтраційних установок — фірми «Альфа-Лаваль» (Швеція), «Мілліпор» (США), ДДС-РО (Данія), «Амікон» (Нідерланди), АІ-ОУВ, АІ-0УП, УЛС-3, УКТ-40, УКФ-80 (Росія).

Зворотній осмос.
Зворотній осмос (гіперфільтрація) — перехід розчинника (води) з розчину через напівпроникну мембрану під дією зовнішнього тиску. Надлишковий робочий тиск розчину в цьому випадку набагато більший за осмотичний. Рушійною силою зворотного осмосу є різниця тиску:

Для розділення речовин застосовують мембрани двох типів:
Пористі з розміром пор 10-4—10-3 мкм (1 —10 Е). Селективна проникність заснована на адсорбції молекул води поверхнею мембрани і її порами. Випускають ацетатцелюлозні мембрани: УАМ-50М, УАМ-500М.
Непористі дифузійні мембрани утворюють водневі зв'язки молекулами води на поверхні контакту. Під дією надлишкового тиску ці зв'язки руйнуються, молекули води дифундують в протилежну сторону мембрани, а на вільні місця, що утворилися, проникають наступні. Таким чином, вода як би розчиняється на поверхні і дифундує всередину шару мембрани. Майже всі БАВ, окрім газів, не можуть проникати через таку мембрану. У нашій країні і країнах СНД Випускають гіперфільтраційні ацетатцелюлозні мембрани МГА-80, МГА-90, МГА-100. Цифра в марці означає відсоток селективності (S):

де С1 і С2 — концентрація речовин в початковому розчині і фільтраті, мг/мл.
На цьому принципі працюють промислові вітчизняні установки типу «Роса», УГ-1, УГ-10, продуктивністю відповідно від 0,1 до 1 і від 1 до 10 м3/сут, і закордонні фірми «Абкор» (США), ДДС-РО (Данія). Звичайно установки зворотного осмосу призначені для однорідних високов’язких рідин, випускають установки двох типів: трубчаті і рулонні, застосовуючи не менше п’яти марок фільтруючого матеріалу, що володіють високою стійкістю до рН (1 —13), селективністю і робочою температурою до 80 °С.
Сорбція.
Методи очищення БАР сорбцією в даний час знайшли широке застосування в хіміко-фармацевтичній і мікробіологічній промисловості.
Сорбцією називається процес поглинання газів, парів, розчинних речовин твердими і рідкими сорбентами. Розрізняють декілька видів сорбції.
Адсорбція — поглинання речовини на поверхні сорбенту. Поверхня сорбенту звичайно дуже велика, оскільки на ній є величезна кількість пір. Так, поверхня 1 г активованого вугілля має площу, рівну 600—1000 м2. Процес адсорбції має селективність і дозволяє адсорбувати визначені БАР з розчину.
Абсорбція — поглинання речовини всім об'ємом твердої або рідкої фази. Абсорбцію. використовують, наприклад, при отриманні ефірних олив. При отриманні ефірних олив анфлеражем квіти розміщують в закриту судину над жиром, який всій своєю масою абсорбує ефірну оливу.
Хемосорбція — поглинання речовин з утворенням хімічних сполук. До хемосорбції відноситься іонний обмін, аффінна і гідрофобна хроматографія. У виробництві БАР рослинного і тваринного походження і на основі біосинтезу в основному використовують адсорбцію.
Сорбціонні процеси.
Сорбційний процес виділення речовин з розчину суміші речовин є єдність процесів сорбції і десорбції. Процес десорбції розділений на два етапи: власне десорбцію, тобто отримання елюата, який містить цільовий продукт, і регенерацію, тобто видалення з сорбенту всіх речовин, що сорбували, дозволяють повернути сорбент знов на стадію адсорбції.
Раціональний вибір адсорбентів, розчинників і умов їх застосування для отримання речовин з розчинів повинен базуватися на наступних положеннях.
1.Адсорбент і умови адсорбції повинні бити вибрані так, щоб вони забезпечували переважну і максимальну сорбцію витягуваної речовини і його мінімальну залишкову концентрацію в розчині в умовах рівноваги.
2. Десорбуючий розчинник і умови десорбції повинні бити вибрані так, щоб в умовах рівноваги елюат з відносно високою концентрацією речовини знаходився б у рівновазі з адсорбентом з малим вмістом речовини, тобто щоб адсорбція з десорбуючого розчинника була б мінімальною.
Слідує відмітити, що обидві ці умови нероздільні одна від одної і, як наслідок вибраний адсорбент повинен забезпечувати їх виконання.
У разі сорбції на молекулярних сорбентах здійснення перших двох умов ведення адсорбційних процесів при виділенні речовин із розчинів зводиться до підбору адсорбенту і умов його використання, які забезпечили б різку відмінність в адсорбційних потенціалах з водного розчину і десорбуючого розчинника.
При підборі таких умов можна виходити з теорії Поляні. По відношенню до розчинів адсорбційний потенціал розчинних речовин в даному випадку описується рівнянням:

де Сн — концентрація насиченого розчину;
СХ — рівноважна концентрація.
Згідно Поляні адсорбуємий об’єм сорбенту завжди повністю заповнений адсорбуємою речовиною і розчинником. При адсорбції розчиненої речовини вона витісняє з адсорбційного об’єму частину розчинника. Тому чим більший адсорбційний потенціал розчинника, тим менша величина сорбції розчиненої речовини.
При виборі молекулярного сорбенту для цілей виділення речовин з розчинів важливу роль відіграє правило «зрівнювання» полярності, встановлене Ребіндером. Згідно цьому правилу адсорбція неполярних речовин на неполярних поверхнях буде успішно походити з полярних розчинників, адсорбція полярних речовин на полярних адсорбентах — з неполярних розчинників.
В якості адсорбентів в технології ліків застосовують пористі тверді речовини з великою питомою поверхнею, найбільш розповсюдженими є: оксид алюмінію, силікагель (гель кремнієвої кислоти), активоване вугілля, кізельгур, поліаміди, поліакриламіди, сефадекси, целюлози і ін.
Адсорбцію проводять в спеціальних апаратах — адсорберах, найпростішим з них є вертикальний циліндровий апарат періодичної дії, який заповнений адсорбентом. Спочатку через адсорбент пропускають розчин і насичують його поглинаючим розчином, потім фільтрують десорбент-розчинник або суміш розчинників, яку витісняє поглинена речовина.
Для проведення неперервної адсорбції застосовують установки з декількох адсорберів періодичної дії, в яких поперемінно відбувається адсорбція і десорбція.
Адсорбційно-хроматографічні методи.
Ці методи широко упроваджуються у виробництво ферментів, гормонів, рекомбінантних ДНК; для отримання БАР рослинного і тваринного походження, до чистоти яких пред'являють особливо жорсткі вимоги, традиційна технологія очищення не підходить. У промисловому виробництві успішно себе зарекомендувала розподільна хроматографія, найнадійніший і ефективний метод очищення. В даний час широко використовують неперервну колоночну і ступінчасту хроматографію. У табл.1. приведенні декілька відомих хроматографічних методів, заснованих на різних параметрах роздільних молекул.
Таблиця 1.
Види хроматографії Використані властивості молекул
Іонообмінна
Гель-фільтрація
Гідрофобна
Афінна Заряд
Розмір
Полярність
Структура
Іонообмінна хроматографія.
Хроматографія БАР за допомогою іонообмінних сорбентів, яка називається іонообмінною, є одним з методів розділення, що мають найбільшу тривалу історію розвитку. В даний час промислова іонообмінна хроматографія стала однією з найважливіших технологічних стадій отримання комерційно важливих кількостей БАР.
У основі іонообмінної хроматографії лежить реакція обміну між нерухомим твердим іонообмінним сорбентом і розчиненою в розчиннику речовиною.
Іонообмінні матеріали.
Іонообмінні сорбенти являють собою нерозчинені у воді речовини, синтетичні або природні, що містять в своїй структурі іоногені групи кислого (катіоніти) або лужного (аніоніти) характеру. Іони водню, які входять до складу іоногенних груп (у разі вмісту катіонітів) або іони гідроксилу (у разі вмісту аніонітів) можуть обмінюватися з катіонами або аніонами, які знаходяться в розчині по реакціях, утворюючи сольові форми іонітів:


де R — високомолекулярний аніон катіоніту або високомолекулярний катіон аніоніту.
При взаємодії катіонітів в Н-формі з розчинами лугів, а аніонітів в ОН-формі з розчинами кислот також відбувається солеутворення у фазі іоніту разом з нейтралізацією розчинів шляхом утворення води по реакціях:


Таким чином, катіоніти в Н-формі представлені нерозчинними кислотами, а аніоніти в ОН-формі — нерозчинними лугами.
Природні іонообмінники — мінерали типу монтморилонтів, каолінатів і ін.
Синтетичні органічні іонообмінники являють собою здебільшого продукти сополімеризації чи поліконденсації різних органічних речовин, у які введені іоногенні групи: і інші у випадку вмісту катіонітів (відповідно до цих груп катіоніти називаються сульфокатіонітами, карбоксильними чи фосфорнокислими); і інші у випадку вмісту аніонітів. У залежності від здатності іоногенних груп до дисоціації катіоніти поділяються на сильно- і слабокислі, а аніоніти - на сильно- і слаболужні. Існують іоніти, що містять у своїй структурі іоногенні групи різної природи, поліфункціональні іоніти, наприклад катіоніт КУ-1, у залежності від рН розчину обмін може відбуватися з різними групами. Полімеризаційні іоніти здебільшого являють собою круглі гранули різного діаметру. При одній і тій же іоногенній групі та основному компоненті матриці вони відрізняються кількістю зшиваючого агента, що зшиває, наприклад, катіони КУ-2-8 і КУ-2-20. Остання цифра характеризує кількість дивінілбензолу, який вводять у реакційну суміш при сополімеризації. Розходження в кількості зшиваючого агента істотно відбивається на такій властивості іонітів, як їх набухання, а це, у свою чергу, відбивається на вибірковості і кінетиці обміну.
Розвиток синтезу органічних іонітів спричинив створення ряду специфічних їхніх різновидів - іонітів, що містять як кислі, так і лужні іоногенні групи (так звані амфотерні іоніти), іонітів з підвищенною гідрофобністю поверхні гранул (олеофільні іоніти), іонітів, що мають пористу структуру за рахунок введення при їхньому синтезі речовин-пароутворювачів (макропористі іоніти) і т.д.. Зараз випускають близько 600 найменувань різних синтетичних органічних іонітів.
Особливим видом іонообмінних матеріалів є іонообмінні мембрани, які складаються з іонітів. Мембрани бувають гетерогенні, тобто коли мілкосумольгенний іоніт нанесений на полімерну індиферентну підкладку, і гомогенні, що являють собою іоніт у виді суцільного листа. Катіонообмінні мембрани мають властивість пропускати через себе (знаходячись у розчині) при накладанні електричного поля тільки катіони, аніонообмінні - лише аніони.
Основні величини, що характеризують іонообмінний процес.
Обмін органічних речовин.
Основною практичною величиною, що характеризує ефективність застосування іонітів для поділу суміші іонів, є концентраційна константа рівноваги відповідної іонообмінної реакції або коефіцієнт вибірковості – Квиб
Квиб
де в квадратних дужках приведена концентрація обмінюючих іонів в іоніті, а в круглих - концентрація відповідних іонів у розчині.
При Квиб = 1 обмін не виборчий. Якщо Квиб < 1, це означає, що Ме+ має меншу спорідненість до іоніту, ніж іон Н+. Якщо Квиб > 1, то більша вибірковість поглинання іона з розчину.
Для здійснення іонообмінного поглинання іон з розчину повинний продифундувати до частинки іоніту, потім продифундувати усередині її до іоногенної групи і, нарешті, повинна відбутися сама іонообмінна реакція.
У залежності від властивостей і структури матриці іоніту, концентрації іонів у розчині, їхніх розмірів і будівлі, а також заповнення ними іоногенних груп іоніту, стадією, що визначає швидкість іонообмінного процесу, може бути або зовнішня, або внутрішня дифузія. Швидкість сорбції у випадку зовнішньої дифузії при лінійній ізотермі сорбції визначається рівнянням:

де - концентрація іона в іоніті в момент часу t;
β - кінетичний коефіцієнт, ;
- коефіцієнт зовнішньої дифузії;
δ - товщина плівки рідини навколо зерна;
r0 - радіус зерна іоніту;
C0 - вихідна концентрація іона в розчині;
С - концентрація іона в розчині в момент часу t, рівноважна з .
Швидкість сорбції при внутрішній дифузії описується рівнянням:

де β2 - кінетичний коефіцієнт, ;
- коефіцієнт внутрішньої дифузії;
r0 - радіус зерна;
- концентрація іонів у іоніті, рівноважна з C0.
З приведених формул випливає, що для визначення швидкості іонообмінного процесу дуже суттєвим є значення величин коефіцієнтів дифузії, які характеризують іонообмінну систему. Для технології важливо установити, який із процесів відповідальний за швидкість сумарного процесу, тому що можливості прискорення поглинання при визначеній ролі зовнішньої чи внутрішньої дифузії різні.
Іонообмінна хроматографія - один із найбільш широко використовуваних методів поділу й очищення білків, завдяки високій здатності сорбентів зв’язувати білок (50,0 г білка на 1 л іонообмінної смоли) і можливості використання різнихх методів елюациї (неперервній і східчастої).
Основний принцип іонного обміну можна проілюструвати рис. 1. На першому етапі водний розчин суміші білків пропускають через стовпчик з нерухомим шаром іонообмінної смоли.

Рис. 1. Іонообмінна хроматографія: операції виділення (принцип методу)
Одним з найбільш широко використовуваних для очищення білків іонообмінником є карбоксиметилцелюлоза - катіонообмінна смола, одержувана за допомогою введення карбоксиметильних груп (які несуть негативний заряд) у целюлозну матрицю. Білки в катіонній формі (які несуть позитивний заряд) зв’язуються з цією смолою електростатичними силами. Потім адсорбуючий білок елюірують буферними розчинами зі зростаючим значенням - рН.
Поступова зміна властивостей елюенту приводить до того, що слабозв’язані з носієм білки десорбуються першими, а потім - усе міцніше зв’язані з іонообмінником. Отже, рухлива фаза, що до введення в стовпчик взагалі не містила білків, на виході зі стовпчика буде збагачена десорбуючими білками. Отриманий при промиванні стовпчика елюат збирають у вигляді фракцій невеликого об’єму. Аналогічно здійснюють і хроматографію на іонообмінних смолах - диетиламіноцелюлозі.
Гель-фільтрація.
Гель-фільтрація, чи хроматографія на молекулярних ситах, дозволяє розділяти речовини з різними молекулярними масами. В такому випадку насадка стовпчика складається із частинок гелю з визначеним діаметром пор. Якщо розмір молекул більший діаметра пор, то вони не можуть дифундувати в гель і бистро проходять через стовпчик, тоді як молекули меншого розміру проникають у гель і тому рухаються повільныше (рис. 2).

Рис. 2. В хроматографії на молекулярних ситах молекули
більшого розміру швидше проходять через стовпчик, а молекули
меншого розміру затримуються, проникаючи в частинки гелю.
Як сорбенти звичайно використовують сефадекси G25, G50, G75, G100, що складаються з полімерних ланцюгів полісахариду декстрана, з’єднані через визначені проміжки поперечними зв'язками, що утворюють своєрідні молекулярны сита. У хіміко-фармацевтичної промисловосты більш широке застосування знаходять сефадекси G25 і G50 у вигляді гранул з діаметром пор 100- ЗО мкм і 20-80 мкм відповідно. Проникність мембрани для кожної з речовин суміші визначається величиною молекули. У цьому зв'язку гель-хроматографію іноді називають молекулярним просіванням. Визначений об’єм розчинника вимиває зі стовпчика речовини з більшою молекулярною масою (сефадекси G25), і з меншою молекулярною масою (сефадскси G25, G50).
Основною величиною, вимірюваною в гель-хроматографії, є утримуваний об’єм Ve :
Ve=V0+Kd ·Vp ,
де V0 і Vp – об’єми рухливої і нерухомої хроматографічних фаз;
Kd - коефіцеієнт розподілу, який залежить від відношення розмірів молекул і пор.
Гель-фільтрація - метод, малочутливий до складу зразка, використовується в основному при видаленні осаджувача, заміні буфера і знесоленні.
Гідрофобна хроматографія.
Метод гідрофобної хроматографії використовують для поділу БАР на основі гідрофобних властивостей, характерних для біологічних об’єктів.
В основі механізму селективності при гідрофобній хроматографії лежить прояв так званого гідрофобного ефекту, а також модуляція електровалентних взаємодій, внаслідок пониження локального діелектричного постійного середовища при введенні неполярних радикалів чи зниженні активності розчинника.
Гідрофобна хроматографія реалізується у вигляді декількох різних процесів. У варіанті, що найчастіше зустрічається, сорбція амфільних з'єднань гідрофобними сорбентами здійснюється з розбавлених водних розчинів при низьких значеннях рН (2,0-4,0), а елюація - шляхом зниження так званої елюатропної сили рухливої фази, що досягається зміною рН, зменшенням полярності елюента (при додаванні спиртів, детергентів і інших органічних модифікаторів). Цей вид хроматографії одержав назву оберненофазної (ОФХ).
При уведенні у розчин амфільних з'єднань, які здатні вступати у взаємодію з розділюючими менш гідрофобними компонентами, останні все-таки можна розділити. Таким методом на неполярних сорбентах вдається розділити навіть іонізуючі з'єднання, якщо додати в розчин протилежно заряджені амфільні з'єднання, які здатні утворювати іонні пари з компонентами, що вивчаються. Цей вид хроматографії був названий іон-парною оберненофазною хроматографією.
Гідрофобна взаємодія реалізується також і при так званій висолюючій хроматографії (ВХ), часто називаємою хроматографією гідрофобних взаємодій, основний прийом якої полягає в сорбції амфільних з'єднань з водних розчинів при великій концентрації солей з наступною елюацією солевими розчинами з більш низькою іонною силою чи водою. Іноді елюацію здійснюють таким чином, що одночасно з зменшенням концентрації солі підвищують концентрацію гідрофобного витискувача. Як в оберненофазній, так і висолюючій хроматографії можуть використовуватися ті самі типи сорбентів із пришитими неполярними радикалами.
Сорбенти для гідрофобної хроматографії.
При проведенні гідрофобної технології потрібно враховувати фізико-хімічні параметри сорбентів: пористість, питому поверхню, гідрофільні і гідрофобні властивості, хімічну стабільність, інертність, проникність. Всім цим вимогам відповідають оберненофазні гідрофобні сорбенти і макропористі гетерогенні полімерні сорбенти типу солоза К 30/40, К 20/40,
К 10/40, КГ 8/40, гідрофобні властивості яких виражені слабше, ніж в оберненофазних сорбентів.
Поверхня кремнеземних сорбентів містить велике число силанольних (SiОН) і силоксановbх груп (Si-О-Si), а також невелика кількість домішок оксидів металів (табл.2). Найбільшою хімічною однорідністю володіють аеросилогели (силохроми), що утворюються спіканням частинок непористого високодисперсного діоксиду кремнію - аеросилу.
Таблиця 2.
Деякі типи кремнеземних сорбентів
для ОФХ біологічно активних речовин
Найменування Розмір пор, нм Питома поверхня, м2/г Об’єм пор, м3/г Форма Вміст
Макропористе
скло 20 – 400 1 – 100 0,4 – 2,3 Гранули сфери-чної і неправи-льної форми, шарові гранули 90% SiO2
40% B2O3
Макропористі
силікагелі 4 – 100 5 – 350 0,4 – 1,2 ------//------- 99,7% SiO2, 0,3% Fe, Al, Ti
Аеросилогелі (силохроми)
Макропориста
кераміка 8 – 70
500 – 1500 100 – 30
0,4 – 1,6 0,8 – 2,0 ------//-------
Гранули непра-вильної форми 90% SiO2, Al2O3, K2O3, Na2O
Поверхнево-шарові кремнеземи 5 – 100 20 – 1 0,1 Гранули з пори-стим поверхневим шаром –
Різні модифікації методів ОФХ широко використовують для очищення пептидів, таких, як окситоцин, ліпресин, АКРГ і його похідних, пептидного гормону росту - соматотропину, пептидннх антибіотиків, лейкоцитарного інтерферону, для поділу високомолекулярних білків (хімотрипсиногену, ферритину й ін.).
Використання гідрофобної хроматографії зручне і при роботі з висококонцентрованими розчинами. Так, розчин амонію сульфату в концентраціях, трохи нижче необхыдних для висолювання білка, сприяє зв’язуванню білків з гідрофобними гелями. Висока концентрація солі знижує розчинність білків і збільшує їх здатність взаємодіяти з неполярною поверхнею сорбенту. Фракціонування зв’язаних білків часто досягається зниженням полярності елюента (наприклад, за допомогою поліетиленгликоля).
При використанні іон-парних агентів досягається додаткове посилення селективност оберненофазних адсорбентів при поділі білків, олігопептидів і інших БАР.
Нижче приведений список катіонних і аніонних амфільних з'єднань, які використовуються в якості іон-парних агентів:
Катіонні Аніонні
R4N+ Алкілсульфонат
R3NH+ Толуолсульфонат
S2NH2 Нафтилінсульфонат
R - органічні радикали С1-С10 Бутилфосфат
Цитрат
Трифторацетат
При підборі умов поділу суміші білків при ОФХ обов'язково враховують рН розчину, в'язкість і температуру.
Афінна хроматографія.
Цікавим хроматографічним методом є афінна хроматографія, заснована на нативній специфічності деяких біополімерів, особливо якщо вони містяться в культуральній рідині в невеликих концентраціях – менше
1 мкг/мл. В цьому методі гарний поділ досягається за рахунок специфічної взаємодії між іммобілізованим агентом і розчиненою речовиною.
Між афінною хроматографією й іншими більш традиційними методами адсорбційної чи іонообмінної хроматографії існують значні розходження. У традиційних хроматографічних методах спочатку адсорбуються всі компоненти суміші, а їхній поділ здійснюється на стадії десорбції за допомогою, наприклад, заміни концентрації елюенту, чи концентрації солей у елюенті, чи поступового підвищення рН елюента. Навпаки, специфічність афінної хроматографії визначається в основному на стадії сорбції (рис. 3). Тому в афінній хроматографії через стовпчик доцільно пропускати розчин поділюваної суміші протягом досить тривалого проміжку часу, поки не буде досягнуто насичення нерухомої фази, тому що в ній адсорбуються практично тільки виділені з'єднання. Таким чином, проведення поділу БАР в афінній хроматографії наближається до звичайної сорбції в нерухомому шарі аж до насичення шару адсорбенту і різко відрізняється від звичайного поділу багатокомпонентної суміші, що вводиться в стовпчик однократно у вигляді концентрованого розчину.

Рис. 3. Схематичне представлення афінної хроматографії:
а - уведення суміші речовин; б - розділення; в - елюювання зв’язаного з нерухомою фазою компонента суміші
В цьому методі гарний поділ досягається за рахунок специфічної взаємодії між іммобілізованим агентом і розчиненою речовиною. Показані три стадії: введення суміші речовин а, поділ б; елюювання, пов'язане з нерухомою фазою компонента суміші в.
Сорбенти для афінної хроматографії.
Сорбентами для афінної хроматографії в основному є полімери, які використовуються для гельпроникаючої хроматографії, після цілеспрямованої модифікації (агарози, поліакриламіди, целюлози, пористе скло).
Найважливіший параметр при модифікації вихідних матриць є об'ємна концентрація, що відповідає угрупованню, яка, як правило, вибирається емпірично. Другий найважливіший параметр - стабільність нанесеного афінату в процесі сорбції - елюації. Якщо афінатами є білки, наприклад, поліклональні чи моноклональні антитіла, білкові і пептидні інгібітори, то стабільність шару афінату можна підвищити, проводячи додаткову міжмолекулярну зшивку. Концентрацію зливаючого агента (наприклад, глутарового альдегіду) потрібно вибирати з урахуванням необхідності уникнути істотної зміни конформації зшитих білків, що часто приводить до втрати афінату.
При виборі вихідного сорбенту приходиться приділяти увагу скороченню розмірів доступних областей у порах після введення в них протяжних афінатів. Тому матриці для біоспецифічної хроматографії з об’ємними афінатами повинні мати діаметри пор, які перевищують в 3-5 разів суму хроматографічних діаметрів макромолекул комплексів антиген-антитіло, білок-інгібітор і т.д..
При використанні білків у якості афінатів потрібно враховувати гетерогенність сорбційних центрів, обумовлену такими факторами, як гетерогенність білків до приєднання (вплив протеаз і денатурації, зміна структури і властивостей афінатів у процесі приєднання), а також у процесі поділу. Цей фактор виявляється особливо суттэвим з точки зору впливу навантаження на стовпчик як при сорбції, так і при виборі умов десорбції.
Сутність методу біоспецифічної хроматографії полягає в тому, що між одним або обмеженим числом білків-ферментів з безлічі наявних у фракційній суміші і полімерним сорбентом утворюється досить стабільний зв'язок, у результаті чого ці білки з розчину переходять на нерозчинний сорбент, що підвищує його селективність.
Висока селективність біоспецифічних сорбентів забезпечується тим, що в якості лігандів використовуються речовини, специфічно взаємодіючі з активним центром виділюваного ферменту. Центром зв’язування служать приєднувальні до полімерним матриць субстрати, їхні аналоги, оборотні інгібітори, коферментн, антитіла й інші речовини, звичайно названі лігандами.
Таблиця 3.
Очищені препарати Ліганди
Ферменти Субстратний аналог, інгібітор, антиген, вірус, антитіла
Гормони, вітаміни Рецептор, білок-переносник
Другим компонентом біоспецифічного сорбенту є полімерна матриця, до якої приєднується ліганд. Матрицею може бути будь-який полімер, у тій чи іншій мірі задовільнячи наступні вимоги:
-великопористість гелевої структури;
-гідрофільність, що забезпечує гарну взаємодію її з водою і відсутність неспецифічного зв’язування білків по гідрофобних центрах;
-відсутність у структурі зарядженних груп;
-здатність полімеру легко активуватися визнвченими хімічними агентами.
Вказаним вимогам відповідають: синтетичні полімери -поліакриламіди, сферони, а також великопористе скло і силікагелі.
Зазвичай хроматографічний процес складається з послідовно мінливих етапів сорбції, видалення несорбованих білків і елюациї сорбованих ферментів.
Великі перспективи відкриває використання моноклональних антитіл для приготування афінних гелів. Досить 4,0-5,0 антитіл, щоб приготувати 1 л афінного гелю. Такі гелі успішно застосовують для виділення із середовища культивування тваринних клітин, наприклад, гормону росту людини - самототропину й інтерферону.
Направлений синтез біоспецифічних сорбентів і вибір режимів афінної хроматографії дозволяє домогтися таких високих ступенів очищення БАР, які недоступні для інших хроматографічних прийомів. За одну стадію ступінь очищення може досягати 102-103 разів.
По своїй природі афінна хроматографія є варіантом адсорбційної хроматографії і її основні закономірності близькі оберненофазній і іншим видам адсорбційної хроматографії. Використовуючи рівняння
,
можна показати, що втримання БАР відбувається тільки за умови , коли концентрація іммобілізованого афінату більше константи дисоціації комплексу фермент-афінат, наприклад, відносне утримання при = 1 моль/л можливе при величині константи дисоціації моль/л. Очевидно, що при використанні афінатів з більшою величиною необхідно підвищувати концентрацію іммобілізованого афінату. Навпаки, при використанні афінатів з дуже малими величинами можна одержати ефективно утримуючі сорбенти навіть при невеликих концентраціях афінатів.

Електрофорез.
Електрофорезом називають поділ БАР завдяки різній швидкості їхнього переміщення в електричному полі. Постійна швидкість досягається частинкою з зарядом q, у рідкому середовищі під впливом електричного поля з напруженістю Е, визначається балансом
.
Для глобулярних білків можна використовувати закон Стокса в застосуванні до опору сфери частинки, що має радіус і рухається в ньютонівській рідині з в'язкістю :

так, що .
Оскільки в загальному випадку кожний білок має свій власний, тільки йому результуючий заряд, то накладання електричного поля приводить до того, що різні білки рухаються з різними швидкостями. Таким шляхом суміш декількох білків можна розділити на індивідуальні компоненти. За допомогою зміни рН можна регулювати електрофоретичну рухливість білка. Якщо рl даного білка менша рН середовища, то його заряд і швидкість будуть негативними. Навпаки, білки з рl > рН будуть рухатися в позитивному напрямку. Цей принцип покладений в основу одного з методів визначення рl білків і інших речовин; у градієнті рН рl білка дорівнює рН, при якому його електрофоретична рухливість дорівнює нулю.
У методі електрофорезу в потоці рідка фаза рухається перпендикулярно направленню електричного поля, що дозволяє здійснювати неперервний поділ. При електрофорезі в гелі на рух молекул БАР впливають процеси адсорбції і десорбції, а також опір дифузії.
Кристалізація.
Процес утворення і росту кристалів з розчинів і газової фази називають кристалізацією. Зазвичай речовини мають строго визначені кристалічні ґрати, за винятком поліморфних речовин. Ряд речовин утворять кристалогідрати, причому кількість включених молекул води залежить від температури. Для утворення кристалів з розчинів необхідно перенасичення, обумовлене різницею вихідної концентрації і рівноважної концентрації насичення (граничної розчинності ). Кристалізація відбувається, коли перехід речовини з рідкого у твердий стан супроводжується зменшенням вільної енергії системи Ф, тобто
,
де р - щільність зародку кристала;
V і F - його об'єм і поверхня;
М - його молекулярна маса;
φ2 і φ1 - хімічні потенціали вихідної і нової фаз;
σ - міжфазний поверхневий натяг.
Для одержання крупнокристалевого порошку кристалізацію проводять при малому перенасиченні, у розчин уводять затравочні кристали, дрібні кристали видаляють у процесі кристалізації, кристалічний продукт повторно оброблюють у насиченому розчині (при цьому дрібні кристали розчиняються), вводять у розчин сторонні домішки, підвищують температуру (обмежено).
Методи кристалізації: випарювання розчинника (ізотермічний), охолодження гарячих розчинів (ізогідричний), одночасне охолодження і випарювання (комбінований), додавання в розчин інших речовин, що знімають розчинність (висолювання), вимерзання.
Схеми кристалізації: однократна (з повним поверненням маткового розчину і періодично повним зливом, з частковим його поверненням, з частковим поверненням після додаткового випарювання і кристалізації), дворазова з такими ж маніпуляціями маточним розчином, причому на злив дають матковий розчин після першого кристалізатора, а після другого - насичений матковий розчин повертають у перший кристалізатор.
У фармацевтичній промисловості кристалізацією виділяють тверді речовини з їхніх розчинів, розділяють суміші речовин на фракції й очищають їх від домішок. Для дуже глибокого очищення термолабільних речовин слідувало б використовувати зонну плавку, для поділу ефтетичних розплавів чи речовин з низькими коефіцієнтами розподілу - екстракціонну кристалізацію. При поділі ефтетичних і азеотропних розплавів доцільно сполучити процеси кристалізації і ректифікації.
Екстракція в системах рідина-рідина.
В основі рідинної екстракції лежить перехід речовини з однієї рідини (розчину) в іншу, що не змішується з першою.
У результаті взаємодії екстрагенту з вихідною рідиною одержують екстракт-розчин витягнутих речовин і рафінат - остаточний вихідний розчин, збіднений витягнутими речовинами і такий, що містить деяку кількість екстрагенту. Перехід речовин відбувається при наявності різниці концентрації між рідкими фазами за законом рівноважного розподілу між рідкими фазами до динамічної рівноваги між ними. Згідно такому закону відношення рівнважних концентрацій розподіленої між двома рідкими фазами речовини є величина постійна (для даної температури), яка називається коефіцієнтом розподілу:
,
де V i x – рівноважні концентрації речовини, що розподіляється, в екстракті і рафінаті, %.
Процес екстракції в системах рідина-рідина складається з наступних стадій: змішування вихідного розчину із екстрагентом для створення між ними тісного контакту, поділ двох рідких фаз, що незмішуються, регенерація екстрагенту, тобто видалення його з екстракту (розчину) і рафінату.
Рідинна екстракція може бути східчастою і неперервною. Східчаста екстракція поділяється на одноступінчасту, що проходить в одному апараті, багатоступінчасту - екстракція протікає в декількох апаратах. Багатоступінчаста екстракція може бити прямоплинною і навпротиплинною.
У промисловості застосовують різні технологічні схеми екстракційних процесів. Апарати для рідинної екстракції працюють за принципом механічного перемішування і гравітації. Апарати, що працюють за принципом механічного перемішування, - це колони з мішалкою і центробіжні екстрактори, що використовують центробіжну силу для змішування і поділу фаз. У гравітаційних апаратах використовується різниця щільностей розчинників. Принцип гравітації лежить в основі роботи різних насадочних колон, з ситчатими тарілками, колонного типу, розпилюючих і інших конструкцій.
Одноступінчата екстракція.
Після змішування первинної витяжки з екстрагентом, суміш розділяється у відстійнику на рафінат і екстракт з концентраціями екстрагуємої речовини - відповідно х і у. Матеріальний баланс процесу у випадку взаємної нерозчинності вихідного розчинника (W) і екстрагенту (D) зображається на діаграмі у - х (рис.4) прямою АВ, точки якої відповідають концентраціям екстракту і рафінату на різних стадіях процесу.

Рис. 4. Схема і зображення процесу однократної екстракції:
1 - змішування; 2 - розливання речовини
Так як максимальна роздільна здатність одноступінчатої екстракції обмежена однією теоретичною ступінню рівноваги, то при її використанні досягається лише обмежене витягування.
Найбільш ефективні неперервні процеси екстрагування, здійснювані в багатоступінчастих апаратах при навпротиплину вихідного розчину. В цьому випадку найбільш повно використовується рушійна сила процесу масообміну, а заданий ступінь екстрагування досягається при найменшій витраті екстрагенту. Схема найпростішого процесу у випадку взаємної нерозчинності вихідного розчинника і екстрагенту приведена на рис. 5. Тут число теоретичних ступенів рівноваги визначається ступінчастою побудовою між кривою розподілу і робочою лінією, рівняння якої визначається з матеріального балансу.
По довжині апарату потоки вихідного розчину, що незмінюються, і екстрагенту рухаються назустріч один одному. Вихідний розчин (хn) виснажується і концентрація екстрагуємої речовини збільшується в рафінаті (у), який виходить з колони, що має кілька ступенів n. Кожна ступінь є порогом, де відбувається віддача екстрагуємої речовини з вихідного розчину в екстрагент.
При екстракційному поділі декількох компонентів (А, В,...), особливо при їхній близькій розчинності, часто використовується екстрагування з двома екстрагентами, при якому вихідна суміш надходить у середню частину колони, а екстрагент – у нижню. В цьому процесі компонент А переходить у фазу одного екстрагенту, а компонент В – в фазу іншого. Деякі конструкції багатоступінчастих апаратів для неперервної навпротиплинної екстракції схематично зображені на рис. 6. Ефективність цих апаратів звичайно оцінюється ККД окремих ступенів чи висотою (довжиною).

Рис. 5. Схема процесу неперервної навпротиплинної екстракції:
1,2,3,4,5,6,7 – контактні пристрої екстракційної колони; х1,х2,х3,х4,х5 – концентрація речовини, що витягається, у вихідному розчині; у1,у2,у3,у4,у5 – концентрація речовини, що витягається, у екстрагенті; х0 і у0 – початкова концентрація речовини, що витягається, у вихідному розчині і екстрагенті; W i D – масові потоки вихідного розчину і екстрагенту, ступені рівноваги яких визначаються ступінчастою побудовою між кривою розподілу і робочою лінією, рівняння якої визначається з матеріального балансу процесу
Рис. 6. Схеми екстракційних колон:
а – розпилююча колона; б – колона з ситковими тарілками; в – насадочна колона; г – роторно-дисковий екстрактор; д - колона з змішуючими і відстійними насадочними секціями, що чергуються (колона Нейбелля); 1 - колона; 2 - розпилювачі; 3 - ситкова тарілка; 4 - переливні труби; 5 - насадка; 6 - розпилювачі; 7 - вал; 8 - плоский ротор; 9 - кільцеві перегородки; 10 - мішалки; 11 - насадка; л.ф. - легка фракція, в.ф. - важка фракція
Для того щоб одержати стійкі емульсії, використовуються конструкції, здатні забезпечити сильне емульгування.
Цілеспрямовано використовувати апарати, в яких досягається гарний контакт фаз за рахунок контакту без їх емульгування. Вигідно використовувати конструкції різних модифікацій, для того щоб кожна ступінь була на порядок вища (рис. 6).
Розпилююсий екстрактор а – це повна колона, заповнена однією з рідин – суцільною фазою – важкою рідиною. Для створення більшої поверхні контакту фаз інша рідина розпилюється за допомогою розподільного пристрою в суцільній фазі. На визначеному рівні краплі дисперсної фази зливаються й утворюють шар, який відділений від суцільной фази поверхнею поділу. Іноді зверху і знизу екстракційна колона розширена, що сприяє кращому відстоюванню фаз. З цього розпилюючого екстрактора рідина надходить у колону із ситковими тарілками б для перепливу суцільної фази. У колоні за допомогою спеціального механізму (пульсатора) рідини повідомляються коливаннями невеликої амплитуди і визначеної частоти. Як пульсатор використовують безклапанний поршневий насос, який приєднаний до днища колони. При пульсуванні відбувається тонке диспергування однієї з фаз, що обумовлює інтенсивну масопередачу. Таким чином, йде рівномірний і поступовий поділ фаз у колонах, що чергуються, різних модифікацій. Наступна колона, у яку надходить рідина – насадочна в. Усередині вона заповнена насадкою, зверху і знизу знаходяться розпилювачі, що подають дві рідини, що незмішуються. Зверху надходить важка фракція, а знизу легка, що рухаються назустріч одна одній. Насадка призначена для створення поверхні контакту фаз. Рідини зливаються й утворюється дисперсна фаза, відділена від важкої фракції поверхнею насадки. Легка фракція переходить через суцільну фазу, утворюючи дисперсний шар, який затримується на насадці. Фракції, пройшовши одна через одну, надходять у роторно-дисковий екстрактор г, де відбувається подальше екстрагування. Роторно-дискова колона має вал, на якому розташовані плоскі ротори. На стінках колони знаходяться кільцеві перегородки. У таких колонах для зменшення зворотнього перемішування і для турбулізації потоків фаз встановлені насадки-перегородки у вигляді тарілок чи кілець. При русі ротора вала і ротора контакт між фазами здійснюється при обтіканні перегородок дисперсною фазою у вигляді тонкої плівки (коалесценції крапель) і при русі крапель дисперсної фази в просторі між перегородками. При контакті важка фракція стікає вниз, а дисперсна фаза залишається на перегородках-кільцях.
Подальше екстрагування відбувається в колоні з чередуючими змішуючими і відстійними насадковими секціями д.
Колона має насадки, що чергуються з мішалками, які призначені для змішування фаз під дією центробіжної сили.
На горизонтальному валу обертаються насадки. Контактуючі рідкі фази подаються за допомогою насосів через вал по каналах. Важка рідина підводиться до периферії насадки. Рідини рухаються навпроти течії, вони багаторазово змішуються при витіканні через отвори в перегородці, і розділяються під дією центробіжних сил. Рафінат і екстракт видаляються також через відособлені канали валу. Апарати цього типу выдрызняються високою інтенсивністю поділу.
Такі апарати, які застосовуються в багатотонажному виробництві, володіють високим ККД ступені (90%). Діаметр їх досягає 6 м, висота - 4 м, а продуктивність перевищує 100 м3/год.
Колони мають різний принцип дії. У гравітаційних апаратах відбувається екстрагування за рахунок різниці щільностей двох рідин, що не змішуються. До таких апаратів відносяться насадкові колони, розпилюючі колони і колони із ситковими тарілками.
Наступні два екстрактори працюють за принципом механічного перемішування, за рахунок центробіжної сили йде змішування і поділ фаз. Це роторно-дисковий екстрактор і колона з змішувальними і відстійними секціями, що чергуються.
Значне поширення одержали ящикові екстрактори (рис. 7), що представляють собою різновид змішувально-відстійних апаратів.
В цих апаратах вертикальними перегородками відділені ступіні, кожна з яких складається зі змішувальної і відстійної камер. У кожній ступіні рух фаз прямоплинний, а по апараті в цілому - навпротиплинний. Транспортування рідин зі ступіні в ступінь здійснюється турбінними мішалками. Такі змішувально-відстійні екстрактори можуть працювати з будь-якими відношеннями розчину і екстрагенту, зберігаючи робочий розподіл концентрацій у ступінях при зупинках. Змішувально-відстійні екстрактори, особливо ящикові, можна збирати в батареї, що складаються практично з будь-якого числа ступіней, що робить їх дуже перспективними при екстрагуванні важкороздільних компонентів. Окремі секції цих апаратів можуть використовуватися для однократної періодичної і неперервної екстракції, а їх групи – для перехрестної.

Рис. 7. Ящиковий екстрактор:
1 – камера змішування; 2 – жалюзійна перегородка; 3 – відстійна камера; 4 – границя поділу фаз; 5 і 6 – різьбові трубки з перекриваючими вікнами; 7 – рециркуляційна труба; 8 – всмоктуючий колектор; 9 – турбінний змішувач
У хіміко-фармацевтичній промисловості широко застосовують різні відцентровані екстрактори, в яких змішування і розділення рідин відбувається в полі відцентрованих сил. Робочий орган деяких екстракторів (ротор) складається з набору перфорованих циліндрів чи спіральних стрічок. Ці машини забезпечують високу продуктивність (до 120 м/год при діаметрі ротора 1,2 м). Пристрій трубчастого відцентрового екстрактора представлений на рис. 8.

Важка рідина Важка рідина

Легка рідина Легка рідина
Легка рідина Важка рідина
Рис. 8. Схема трубчастого відцентрованого екстрактора
Циліндричний барабан 3 має швидкість обертання 1500- 5000 об/хв. Усередині барабан розділений перфорованими перегородками 7 на ряд екстракційних ІІ, ІV, VІ і сепараційних І, ІІІ, V, VІІ ділянок. Рідини надходять у барабан по відособленим каналах, що проходять всередині нерухомого циліндра 4. Важка рідина подається по каналі 2 у нижню екстракційну ділянку VІ, легка - по каналі 6 у верхню екстракційну ділянку ІІ. Рухаючись в барабані навпроти течії, рідини багаторазово перемішуються, проходячи між нерухливими перфорованими дисками 5, закріпленими на циліндрі 4. Емульсія, яка утворилася при цьому, попередньо розслоюється при проходженні через перфоровані відбійні перегородки 7, які зроблені у вигляді декількох дискових чи конусних тарілок. Остаточний поділ фаз відбувається під дією відцентрової сили в сепараційних ділянках. Рідкі фази (екстракт і рафінат) видаляються з екстрактора через відособлені канали: легка - через верхній кільцевий злив 8, важка - через нижній 1.
У деяких виробництвах (антибіотики) такі апарати, забезпечуючи дуже незначний час контакту фаз, є незамінними; крім того, такі екстрактори застосовуються при дуже малій різниці в питомій вазі обох фаз, при утворенні стійких емульсій і ін.
Розпилюючі колони, які застосовувалися раніше, механічний, горизонтальний екстрактор з обертовою насадкою, показали їх незручність у роботі (часті промивки екстрактора, негерметичність установок, необхідність строгого і постійного контролю). Запропонований відцентровий екстрактор багатоступінчастий (раніше застосовувався в ядерному військовому виробництві) дуже компактний, високоефективний, малометаловмнісний, малоенерговмнісний. Не дає емульсій, дуже легко збільшується ступінь витягу введенням додаткових ступіней.
Розглянемо принцип дії відцентрового багатоступінчастого екстрактора на прикладі готування фламіну (рис. 9.).

Рис. 9. Схема багатоступінчастого відцентрового екстрактора:
1, 2, 3, 4, 5, 6 – відцентровані екстрактори
Кожний екстрактор установки має камеру змішування і камеру поділу (ротор). У камері змішування за допомогою мішалки йде екстракція діючих речовин. У роторі відбувається поділ водяного середовища і етилацетатно-спиртової суміші за рахкнок різниці щільностей під дією відцентрованих сил. Після поділу розчини надходять у наступну ступінь. Подача розчинів в установку здійснюється за принципом навпротиплинності.
Водяний концентрат фламыну надходить в установку через ротаметр на останню 6 секцію і заповнює всю установку. А в секцію 1 подають етилацетатно-спиртову суміш, теж через ротаметр. Пройшовши послідовно всі стадії установки, етилацетатно-спиртова суміш навпротиплинністю витягає фламін з водяного концентрату і надходить у збірник. У процесі екстракції плавно встановлюють швидкість подачі суміші і водяного концентрату.
Після встановлення режимних швидкостей подачі розчинів для досягнення заданого ступеня виснаження водяного концентрату продовжують збір водяного концентрату в проміжний збірник, після чого зливши вже виснажений водяний концентрат переключають у збірник-відстійник.
По закінченні процесу екетракції перекривають подачу суміші і водяного концентрату і відключають установку.
За допомогою вакууму звільняють відцентровані екстрактори від залишків розчинів у проміжний збірник.
Етилацетатно-спиртові витягнення із збірника подають за допомогою вакууму в розділову лійку для відстоювання.
Відстояні витягнення подають для випаровування в циркуляційний вакуум- випарний апарат.
ОДЕРЖАННЯ ГОТОВОЇ ПРОДУКЦІЇ (П'ЯТА СТАДІЯ)
Відомо, що до БАР біотехнологічного походження, що використовуються у медичній практиці, висувають дуже високі вимоги: високий ступінь очищення; фармакологічна активність; стерильність.
Тому на цій стадії роботи, а також під час хімічного очищення препарату необхідно дотримуватися високого ступеня чистоти: підтримувати у надзвичайній чистоті не тільки використане обладнання, але й приміщення, де проходить біосинтез.
Після виділення і хімічного очищення БАР її необхідно висушити - видалити з препарату вільну і зв'язану воду. Оскільки деякі БАР, отримані за цією технологією, у тому або іншому ступені термолабільні, для їх висушування необхідно застосовувати методи, які не призведуть до втрати біологічної активності і не змінять кольору препарату. На сучасному етапі одержання БАР застосовують різні методи зневоднювання препарату. Крім звичайних методів сушіння, широкого поширення набуло ліофільне висушування БАР, що проводиться при порівняно низьких температурах (від -8 до -12 °С).
Прогресивним методом при роботі з великою кількістю розчину, що містить БАР, є висушування із застосуванням розпилювальних сушарок. Розчин БАР пневматично розпилюється до дрібних крапель у камері потоком нагрітого повітря. Процес висушування БАР проходить протягом кількох секунд. При цьому навіть термолабільні речовини не змінюють своїх властивостей.
Фасування порошків проводять в основному в посудини, виготовлені із оранжевого скла.
Готовий порошок піддається ретельному аналітичному, біологічному і фармакологічному контролю.
ВИРОБНИЦТВО РЕКОМБІНАНТНИХ ФАРМАЦЕВТИЧНИХ БІЛКІВ ТРАНСГЕННИМИ РОСЛИНАМИ -«МОЛЕКУЛЯРНЕ ФЕРМЕРСТВО»
Виробництво фармацевтичних білків, антитіл, вакцин на основі генноінженерних підходів є яскравим прикладом тих переваг, які надає сучасна біотехнологія рослин. Такі білки та пептиди називаються рекомбінантними, тому що їх отримують з використанням технології рекомбінантних ДНК. Очевидно, першим практичним результатом в цій галузі слід вважати патент фірми «Сalgnе» на експресію інтерферону миші в клітинах рослин. Пізніше була встановлена можливість синтезу імуноглобулінів у листках трансгенних рослин, інших білків людини і тварин.
Рослина як природний біореактор з виробництва рекомбінантних білків має певні переваги порівняно із клітинами тварин, людини та мікроорганізмів:
рекомбінантні білки, синтезовані в рослині, не потрібно піддавати денатурації та ресинтезу;
рослини здатні не лише до синтезу і збирання, а й до глікозилювання білків тварин; це абсолютно необхідно для синтезу антитіл і деяких інших функціонально повноцінних білків;
рослини порівняно із клітинами ссавців і трансгенними тваринами, забезпечують значне здешевлення виробництва рекомбінантних білків, причому без обмежень, пов'язаних зі зростання обсягів такого виробництва; наприклад, якщо середня вартість очищених пептидів, отриманих за допомогою інших сучасних методів, становить 100 тис. — 1 млн дол. США за 1 кг, то їх вартість у разі отримання із трансгенних рослин дорівнює 1 тис. дол. США за 1 кг;
у препаратах, отриманих із рослин, порівняно з препаратами тваринного чи мікробіологічного походження значно менше або й зовсім відсутні небажані віруси та пріони; відсутні домішки, що мають алергічну, імуносупре-сивну, канцерогенну, тератогенну дію на організм людини; це зумовлює порівняну легкість очищення синтезованих рослинами фармацевтичних пептидів;
під час вживання сирих овочів і фруктів, що містять гени, які кодують синтез білків—вакцин, відбувається імунізація організму.
Існує кілька підходів у індукції синтезу рекомбінантних білків у рослинах, основними з яких є:
отримання трансгенних рослин із вбудованими генами рекомбінантних білків; такі рослини, представники різних видів, що несуть різноманітні гени синтезу рекомбінантних білків, вже отримані, деякі з них випробовують для комерційного використання; недоліком цього підходу є відносно невисока концентрація рекомбінантного білка, що зменшує можливість використання таких рослин для виробництва очищених препаратів; тому ця технологія застосовується для виробництва їстівних вакцин або інших білків, які можуть споживатись в неочищеному стані; модифікації, що ґрунтуються на можливості як спонтанної, так і індукованої секреції (ексудації) рекомбінантних білків у живильне середовище у разі вирощування трансгенних рослин в умовах гідропоніки, застосовуються для отримання очищених препаратів рекомбінантних білків; наприклад, у рослини тютюну трансформована кодуюча послідовність лужної фосфатази людини (SЕАР) під промотором манопінсинтази, який експресується у коренях; під час культивування коренів трансгенних рослин у рідкому середовищі основним компонентом ексудату коренів є рекомбінантний білок SЕАР
використання трансформації хлоропластів; цей метод дає змогу різко збільшувати кількість потрібного білка в листках транспластомних рослин; так, накопичення соматотропіну людини (гормон росту), ген якого було внесено в хлоропласти тютюну, становило до 7 % усього розчинного білка транспластомної рослини; в окремих випадках рівень рекомбінантного білка може навіть досягати 47 % сумарного розчинного білка; проте широке застосування цієї технології поки що стримується труднощами трансформації хлоропластів;
використання позаклітинних генетичних елементів; перші подібні генетичні конструкції були створені на базі РНК-вмісного вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ); ген біосинтезу цільового білка клонують під контролем промотору вірусу (звичайно використовують субгеномний промотор білка оболонки вірусу) в бактеріальному векторі, який містить повну кДНК копію вірусної РНК; потім у безклітинній системі на основі отриманого вектора синтезується вірусна РНК, яка наноситься на пошкоджені листки тютюну або споріднених видів; протягом 1—2 тижнів відбувається накопичення вірусних часточок, що містять рекомбінантний білок; така система дає змогу за короткий термін накопичувати значну кількість цільового білка в листках інфікованої рослини (2—10 %, іноді до 20 % загальної кількості рослинного білка); з використанням цього підходу в США розроблено метод лікування одного з типів лімфом (неходжківської лімфоми); причина цієї хвороби полягає в активному розмноженні В-лімфоцитів, причому у кожного пацієнта розмножується індивідуальний клон лімфоцитів, що несуть на своїй поверхні специфічні антитіла; специфічність антитіл визначається сайтом зв'язування, одночасно ця сама ділянка слугує антигеном для синтезу антитіл проти себе; сутність лікувального підходу полягає в тому, що у пацієнта індукується синтез своїх антитіл, специфічних до сайту зв'язування антитіл клону В-лімфоцитів, що злоякісно розмножуються; за класичного лікарського підходу на основі В-лімфоцитів пацієнта отримують гібридоми, які продукують такі специфічні антитіла, а вже на їх основі готують ад'юванти (стимулятори імуногенезу) для вакцинації пацієнтів; проте отримання гібридом і накопичення достатньої кількості антитіл потребує багато часу і коштів, оскільки така технологія застосовується індивідуально для кожного пацієнта.
Новий підхід ґрунтується на клонуванні послідовності ДНК, що відповідає сайту специфічності антитіл лімфоцитів, потім створюється вірусний вектор, яким інфікуються рослини будь-якого виду тютюну. В листках таких рослин швидко накопичується відповідний рекомбінантний білок. Цей метод дає змогу вже через 2—3 тижні отримати необхідну індивідуальну вакцину для лікування пацієнта. На сьогодні завершуються клінічні випробування таких вакцин.
Системи швидкого перепрограмування рослин постійно удосконалюються. Наприклад, внесення генетичного матеріалу в рослини можна здійснювати шляхом агробактеріальної інфільтрації. У цьому випадку генетичний матеріал попадає в клітину після ін'єкції в листки рослини агробактерій, які містять відповідний вектор. Агробактерії переносять свою тДНК в клітини мезофілу листка. У тДНК агробактерій вбудована кДНК, отримана на основі необхідних для утворення і проліферації вірусу ділянок вірусної РНК, а також ген (гени) рекомбінантного білка. В рослинних клітинах утворюється РНК після зчитування тДНК. Далі відбувається процес, аналогічний зараженню вірусними РНК. Такий підхід дає змогу обходитись без синтезу РНК у безклітинній системі, а також використовувати не лише цілісні, але й розділені ділянки генів, які клоновано в різні штами бактерій. Ці гени остаточно збираються всередині рослинної клітини після одночасної інфільтрації цими штамами агробактерії.
На основі описаних технологій створені трансгенні рослини, які використовують для виробництва оральних вакцин, що має велике економічне значення, особливо для країн, що розвиваються, у зв'язку із значним здешевленням їх отримання і відсутністю потреби очищення у випадках перенесення відповідних генів у фрукти і овочі, що вживаються у сирому вигляді.
До білків широкого використання, які внаслідок низького рівня синтезу в специфічних тканинах чи продуктах є рідкісними, належить лактоферин, що знаходиться в невеликій кількості у молоці ссавців, лейкоцитах крові. Лактоферин людини (hlf) перспективно використовувати як харчову добавку і лікувальний препарат для профілактики і лікування інфекційних захворювань шлунково-кишкового тракту дітей раннього віку, підвищення імунної відповіді організму в разі злоякісних і вірусних (СНІД) захворювань. Отримання лакто-ферину з молока великої рогатої худоби внаслідок його низького вмісту призводить до високої вартості препарату. Під час введення кДНК гена лакто-ферину в клітини тютюну отримано ряд калюсних тканин, що синтезують вкорочений лактоферин, антибактеріальні властивості якого значно сильніші за антибактеріальні властивості нативного лактоферину. Концентрація цього вкороченого лактоферину в клітинах тютюну досягає 0,6—2,5 %.
За допомогою агробактеріальної трансформації отримано трансгенні рослини тютюну, що несуть ген білка оболонки вірусу лихоманки свиней, трансгенні рослини і калюсні тканини тютюну, що експресують білки вірусу гепатиту Б. Під час годування мишей цими трансгенними рослинними продуктами у них був ідентифікований синтез специфічних антитіл.
Гени великого і середнього антигену білка оболонки вірусу гепатиту Б, білка G кроля, епідермального фактора росту людини і кальцитоніну людини експресовані у рослинах картоплі. Рівень експресії інтродукованих генів дорівнює від 20 до 90 нг/мг розчинного білка залежно від генетичної конструкції й типу тканини рослин. Імуногенні властивості білків середнього антигену нижче від більшого антигену рослини і вакцини. Показано, що ізольований із рослин білок середнього антигену може бути використаний для оральної імунізації.
Доведена можливість збирання повного тетрамерного імуноглобуліну в трансгенних рослинах. Рекомбінантний імуноглобулін зберігає нативну конформацію. Під час вирощування трансгенних клітин у суспензійній культурі полімерні імуноглобуліни виділяються в культуральне середовище.
Можливе отримання у трансгенних рослинах білків ссавців зі зміненими властивостями. У такий спосіб змінена структура важкого ланцюга антитіла ІgС1. Трансгенні рослини синтезують альбумін людини, моноклональні антитіла, вакцини, фітази, бактеріальну α-амілазу.
Трансгенні рослини (продуценти аутоантигенів) використовують у разі інших аутоімунних хвороб, таких, як множинний склероз, ревматичний артрит, інсулінзалежний діабет і навіть відторгнення під час трансплантації органів. Інсулінзалежний діабет є аутоімунним захворюванням, за якого клітини підшлункової залози, що продукують інсулін, руйнуються власними Т-лімфоцитами. Оральне вживання значної кількості імуногенних білків може привести до запобігання і значного затримання проявів симптомів аутоімунних хвороб. Білки інсулін і панкреатична декарбоксилаза глютамінової кислоти розглядаються як оральні вакцини для запобігання інсулінзалежного діабету. Канадськими біотехнологами отримано трансгенні рослини картоплі, що синтезують панкреатичну декарбоксилазу глютамінової кислоти. В разі годування такою картоплею схильних до діабету мишей відмічено зменшення як випадків діабету, так і величини аутоімунної відповіді.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Бутенко Р.Г. Рост и дифференциация в культуре клеток растений // Рост растений и природные регуляторы – М.: Наука, 1977.
2. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. – М.: Наука, 1986.
3. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: Учеб. пособие – М.: ФБК-ПРЕСС, 1999.
4. Гамбург К.3., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тка-ней и клеток растений – Новосибирск: Наука, 1990.
5. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений – Киев: Наукова думка, 1984.
6. Калинии Ф.Л., Бутенко Р.Г. Методы культуры тканей в физиологии рас-тений – Киев: Наукова думка, 1980.
7. Калинин Ф.Л., Кушнир Г. П., Сарнацкая В.В. Технология микрокло-нального размножения растений – Киев: Наукова думка, 1992.
8. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений – М.: Наука, 1983.
9. Клеточная инженерия / Р.Г. Бутенко, М.В. Гусев, А.Ф. Киркин // Биортехнология. Т. З. – М.: Высшая школа, 1987.
10. Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии: Методические указания / Сост. Г.М. Артамонова, С.И. Герасимова, С.В. Дегтярев, Е.З. Кочиева, Д.В. Калашников, И.К. Блиновский, Л.И. Хрусталева. Под ред. акад. ВАСХНИЛ В.С. Шевелухи. Москва: Изд-во МСХА, 1991.
11. Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодо-водстве и цветоводстве / Сб. науч. трудов ВНИИГиСП – Мичуринск, 1989.
12. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Порофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологий. – М: Наука, 1990.

Приложенные файлы

  • docx 674926
    Размер файла: 601 kB Загрузок: 1

Добавить комментарий