Дипломна чалбаш 4.06.2014

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
ДЕРЖАВНИЙ ВИЩИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД
«УЖГОРОДСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ»
Біологічний факультет
Кафедра генетики, фізіології рослин і мікробіології



ДИПЛОМНА РОБОТА
____________«Магістр»___________
(освітньо-кваліфікаційний рівень)

на тему: «БАКТЕРІАЛЬНІ ХВОРОБИ ПЛОДОВИХ КУЛЬТУР ЗАКАРПАТСЬКОЇ ОБЛАСТІ»






Виконала: студентка5курсу
Чалбаш Наталія Володимирівна _____8.04010201 «Біологія
·»_____
(шифр і назва напряму підготовки, спеціальності)
Керівник к.б.н., доц. В.І. Петросова
Рецензент к.б.н., доц. каф.
плодоовочівництва і виноградарства
Маргітай Л.Г.


Ужгород – 2014


ЗМІСТ


РЕФЕРАТ.3
вступ......................................................................................................................4
РОЗДІЛ 1. Огляд літератури..........................................................................7
Класифікація захворювань, що вражають рослинні організми..7
Загальна характеристика фітопатогенних бактерій та факторів вірулентності.10
Типи патологічних змін у рослин, викликані бактеріями ....13
Взаємовідносини фітопатогенних бактерій з рослинами-господарями та зовнішнім середовищем............18
Розповсюдження фітопатогенних бактерій ..22
Біологія фітопатогенних бактерій.......26
Фітопатогенні мікоплазми...32
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ........37
РОЗДІЛ 3. Результати досліджень та їх обговорення................46
Висновки.......................................................................................................59
RESUME........61
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ.........................................................63



РЕФЕРАТ
до дипломної роботи
на тему: «Бактеріальні хвороби плодових культур Закарпатської області»


Дипломна робота містить 66 сторінок, 2 таблиці, 13 рисунків, список використаних джерел та літератури із 41 найменувань.
У роботі висвітлені та наведені результатививчення бактеріальних захворювань виявлених на території Закарпатської області.
Ключові слова:бактеріоз, патогенність, агресивність, токсичність,бактеріальний опік плодових, бактеріальна плямистість.



ВСТУП


Актуальність теми Захист рослин від фітопатогенних бактерій нині є однією з найважливіших проблем аграрного виробництва, оскільки їх розвиток та здатність уражати всі культурні види рослин призводить до істотних матеріальних збитків. Значне поширення бактеріозів у плодових насадженнях зумовлює необхідність їх вивчення, чіткої ідентифікації збудників та розроблення комплексу заходів захисту рослин.
Відомо, що втрати врожаю від шкідників, хвороб та бур’янів в Україні щороку становлять від 30 до 50%. Значна частина цих втрат спричинена бактеріальними хворобами рослин, до яких особливо чутливими є представники агроценозів, оскільки в агроценозах послаблена дія природних антагоністів збудників хвороб. Збудниками бактеріозів рослин є величезна кількість мікроорганізмів представників різних систематичних груп широко розповсюджених в природі. Тому вивчення особливостей їх біології, способів ураження рослин та методів запобігання хвороб є особливо актуальним.
Негативна роль бактеріозів зростає в умовах концентрації і спеціалізації аграрного виробництва, що зумовлює накопичення інфекції та створення сприятливих умов для поширення захворювання. У зв’язку з цим слід враховувати, що досконалу систему заходів боротьби із фітопатогенними бактеріями слід будувати виключно на основі чітких даних щодо діагностики бактеріозів та біологічних властивостей їхніх збудників. Значущість вирішення цієї проблеми і обумовила вибір теми дипломної роботи.
Бактеріоз – це складний патологічний процес, який виявляється в порушенні обміну речовин і фізіологічних функцій ураженої рослини. Шкідливість бактеріальних хвороб виражається в ослабленні дерев, втраті товарної якості плодів та урожайності, а при сприятливих умовах розвитку деяких хвороб – в повній загибелі рослин. При загальних захворюваннях уражається вся рослина чи більша її частина. Збудник проникає в судинну систему, розповсюджується в провідних пучках та прилягаючих до них тканинах. При цьому погіршується нормальний процес надходження води в рослину і вона гине. Локальні бактеріози проявляються в ураженні паренхімних тканин окремих органів рослин – листків, пагонів. Але в даному випадку хвороба не поширюється по всій рослині [5, 33].
Симптомами бактеріозів є гнилі, некрози, п’ятнистість, виразки, нальоти, пухлини, деформація.
Загальними ознаками всіх збудників є:
патогенність – здатність викликати захворювання;
вірулентність – спектр ураження;
агресивність – швидкість та масовість ураження.
Проникнення збудника можливо за допомогою гризучих комах, через механічні пошкодження, через природні ходи рослин [5].
Метою дипломної роботи було мікробіологічне виявлення збудників бактеріозів у плодовому фітоценозі, для визначення та вивчення захворювань, що загрожують багаторічним насадженням області. А також виділення та вивчення властивостей збудників, розроблення заходів обмеження поширення та контролю захворювань.
Досягнення поставленої мети передбачало вирішення таких завдань:
– виявлення збудників бактеріальних захворювань у плодовомих фітоценозах Закарпатської області;
– встановлення патогенних, морфологічних, культуральних, фізіологічних, біохімічних та серологічних властивостей виділених ізолятів, необхідних для їхньої ідентифікації;
– вивчення симптомів бактеріального опіку та бактеріальної плямистості плодових на різних періодах вегетації рослин-господарів;
Методи дослідження: в роботі використано фітопатологічні, мікробіологічні, біохімічні, серологічні та математичні методи моделювання.
Наукова новизна одержаних результатів полягає в наступному:
– підтверджено наявність на території України збудника бактеріального опіку плодових Erwinia amylovora;
– встановлено гетерогенність популяції E. amylovora за агресивністю. Високий відсоток агресивних клонів популяції виявлено в сильно уражених тканинах квіток, листків, молодих пагонів. У корі, стовбурі та скелетних гілках інфекційний процес відбувається повільніше, тому в популяції переважають слабоагресивні та неагресивні клони;
Практичне значення одержаних результатів. Для практичного використання запропоновано модель прояви симптомів бактеріального опіку плодових, яка дає можливість вчасно застосовувати превентивні заходи захисту рослин.
Результати досліджень можуть стати компонентою системи заходів локалізації та ліквідації захворювання на території Закарпатської, Чернівецької та інших областей України.
Апробація результатів та публікації. Матеріали роботи у вигляді доповіді представлені на науковій студентській конференції та у вигляді тез у збірниках «Проблеми збереження біорізноманіття Українських Карпат: Матеріали V регіональної конференції молодих вчених та студентів 10 квітня 2012р». – Ужгород, 2012. – С.60, «Проблеми збереження біорізноманіття Українських Карпат: Матеріали VI регіональної конференції молодих вчених та студентів 17 квітня 2013р». – Ужгород, 2013. – С.108 та «Проблеми збереження біорізноманіття Українських Карпат: Матеріали VII регіональної конференції молодих вчених та студентів 24 квітня 2014р.» - Ужгород, 2014. – С.81.




РОЗДІЛ 1
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ


Класифікація захворювань, що вражають рослинні організми

Загальна схема класифікації хвороб рослин за етіологією можна поділити на:
1) неінфекційні;
2) інфекційні.
За зовнішнім виглядом хворих рослин виділяють такі типи вражень:
1) вілт (в'янення);
2) пустули і виразки;
3) некрози;
4) нальоти;
5) гниль;
6) деформація;
7) муміфікація;
8) руйнування органів;
9) новоутворення;
10) камедетечі;
11) поява на рослині сторонніх організмів [17].
По рослинах, що живлять хвороби, їх можна розділити на хвороби овочевих, кормових, зернових, плодових, ягідних культур і т.п. – це найпростіша класифікація, що використовується в сільському господарстві.
По локалізації на рослинах хвороби ділять на:
1) місцеві (локальні) – плямистості і нальоти;
2) системні (дифузні) – в'янення.
За тривалістю хвороби поділяють на:
1) гострі – розвиваються протягом 1 вегетаційного періоду;
2) багаторічні (хронічні) – які можуть тягнутися роками.[9]
За віком живлячої рослини розрізняють:
1) хвороби молодого віку (рослину вважають молодою, поки у нього не зімкнулась крона);
2) хвороби дорослих рослин;
3) хвороби старечого віку (наприклад, гнилі деревини, молочний блиск на яблуні) [5].
У роботах новосибірської школи фітопатологів отримала розвиток епіфітотична (екологічна) класифікація, покликана суттєво полегшити розробку заходів профілактики епіфітотій. У цій класифікації значну роль грають поняття "джерело збудника інфекції" і "фактор передачі збудника".
Джерелом збудника інфекції тут вважається хвора рослина, а фактором передачі – ділянка навколишнього середовища, куди збудник хвороби потрапляє з джерела інфекції і звідки він потрапляє в нового господаря. За факторами передачі інфекції бувають:
1) грунтові (кореневі) – хвороби поширюються через грунт, заражаючи коріння рослини;
2) насіннєві (матрикально-дочірні) – такі інфекції передаються минаючи навколишнє середовище, від материнської рослини до дочірньої;
3) повітряно-крапельні (листово-стеблові) – хвороби поширюються через повітряне середовище (вітром) з краплями дощу і заражають листя чи стебла рослин;
4) трансмісивні – такі інфекції передаються від рослини до рослини іншими організмами, переносниками. Наприклад, махровість чорної смородини передається бруньковим кліщем [18].
Традиційно в посібниках з фітопатології наводиться етіологічна класифікація хвороб рослин:
А. Фактори неживої природи
1. Грунтові умови:
а) вологість грунту – нестача, надлишок, нестійке постачання; б) структура грунту – перешкоди проникненню коренів, водоутримуюча здатність, аерація; в) постачання киснем; г) хімічний склад – нестача, надлишок, порушення правильного балансу макро- і мікроелементів, шкідливі солі, реакція грунту.
2. Метеорологічні умови: а) світло – нестача, довжина дня; б) температура – відхилення в будь-яку сторону від оптимальної, вкрай низькі або вкрай високі температури, коливання температури; в) відносна вологість – нестача, періодичний надлишок; г) вітер – механічні пошкодження, висушування; д) проливні дощі, сніг, паморозь – механічні пошкодження, особливо в поєднанні з вітром; е) град – механічні пошкодження; ж) блискавки.
3. Шкідливі виробничі впливи – механічні пошкоджень; шкода хімічного характеру від фунгіцидів, інсектіці і гербіцидів.
4. Відходи промислового виробництва – газоподібні відходи металургійних підприємств та інші дими; кіптява; гази; пил від цементних заводів.
5. Продукти обміну речовин у рослин – особливо при зберіганні і перевезеннях [16].
Б. Фактори живої природи
1. Тваринний світ: а) комахи; б) нематоди; в) кліщі; г) вищі тварини (випадкові непрямі причини – витоптування, гризіння).
2. Рослинний світ: а) слизняки; б) бактерії; в) гриби; г ) водорості; д) насіннєві рослини.
В. Віруси [16].


1.2.Загальна характеристика фітопатогенних бактерій та факторів вірулентності

Хвороби рослин, що виникають під впливом бактерій, називаються бактеріальні хвороби або бактеріози. Вони географічно широко поширені і важливі в економічному відношенні, адже наносять велику шкоду сільському господарству, особливо в період зберігання плодів, овочів і зерна, викликаючи їхню загибель.
Бактерії відносяться до нижчих безхлорофільних організмів, які вимірюються в мікронах і відрізняються примітивною організацією.
Всі фітопатогенні бактерії відносяться до паличкових форм; вони бувають поодинокі, а також сполучені попарно і в ланцюжки. Більшість бактерій рухливі і мають полярний джгутиковий апарат. Основна маса бактерій збудників хвороб рослин спор не утворюють; відомо лише кілька видів спороносних (Pseudomonas trifoliorum Stapp.) [8]. Так як фітопатогенні бактерії не утворюють спор, важливе значення для них має капсула, або слизиста речовина. Поміщена в таку капсулу бактерія стійка до завнішніх впливів (тепла, світла, радіації, хімічних речовин), і тому вона довгий час може підтримувати свою життєдіяльність.
При наявності сприятливих умов бактеріальна клітина починає ділитися. Зазвичай це відбувається без статевого процесу, шляхом простого поділу клітини на дві рівні частини. Хоча для деяких видів бактерій характерне і статеве розмноження [11].
Для збудників хвороб рослин характерні такі властивості, що визначають виникнення інфекцій: патогенність, вірулентність, інфекційність, агресивність, інвазійних, токсичність [6].
Під патогенністю розуміють здатність мікроорганізмів викликати захворювання певного виду рослин і завдавати йому шкоди. Ця властивість може змінюватися в залежності від циклу розвитку збудників та зовнішніх умов. Факультативні форми, що викликають загибель великих ділянок, можуть бути більш патогенними, ніж облігатні, що викликають місцеві ураження тканин [6].
Агресивність – кількісна міра патогенності. Це здатність паразита викликати масове зараження сприйнятливих рослин (епіфітотії), долаючи їх захисні властивості. Високоагресивних вважаються збудники, здатні викликати зараження рослин при мінімальній кількості (дозі) інфекційного початку. Агресивнішими є облігатні форми патогенів, менш агресивними – факультативні.
Агресивність характеризується такими показниками, як:
1) інфекційне навантаження – кількість пропагул паразита, необідна для зараження господаря;
2) швидкість встановлення паразитичних відносин;
3) швидкість появи симптомів (інкубаційний період);
4) кількість рослин, що заражаються паразитом за період часу, який часто визначається величиною утворення потомства у фітопатогена [22].
Вірулентність – якісна міра патогенності. Це патогенність даного паразита по відношенню до певного виду або сорту рослин-господарів. Один і той же збудник може бути вірулентним для одного сорту і авірулентним для іншого. За ознакою вірулентності виділяють раси збудника (для грибів особливо) в межах одного і того ж виду патогена [11].
Основними факторами вірулентності фітопатогенних бактерій є:
1) продукція пектолітичних ферментів (пектиназ, протопектиназ, полігалактуроназ), які руйнують пектинові речовини, із яких складається між клітковий простір рослинних тканин. Це призводить до мацерації, або розпаду, рослинної тканини і утворення «мокрої» гнилі;
2) виділення целюлолітичних ферментів (целюлаз, геміцелюлоз), які руйнують стінки рослинних клітин;
3) утворення токсинів, які діють на чутливі рослини, і порушують відповідні ферментативні системи, обмін речовин і викликають відмирання або в’янення уражених тканин чи органів. Токсини фітопатогенних бактерій – речовини різноманітної хімічної природи. Токсин, який синтезують бактерії Pseudomonas syringae, є низькомолекулярним пептидом, що інгібує синтез глутамінсинтетази, яка необхідна для утворення хлорофіла. В результаті на листках з’являються плямистості. В якості токсинів можуть бути полісахариди і глікопептиди слизових шарів бактерій;
4) синтез фітогормонів, які стимулюють розростання тканин рослини з утворенням пухлин, наприклад, гетероауксин індолілоцтова кислота, що синтезується бактеріями Agrobacterium tumifaciens. Пухлини можуть викликати стиснення провідних судин з подальшою загибеллю рослини. До фітогормонів також належать гіберелін, який синтезується бактеріями і викликає аномальне видовження пагонів [6].
Фітопатогенні організми характеризуються спеціалізацією. Спеціалізація патогенів – це приуроченість їх до певного харчового субстрату і здатність заражати певне коло рослин. Для того, щоб фітопатогена міг паразитувати на рослині, – тобто отримувати від нього необхідні поживні речовини, по-перше, ці речовини повинні бути присутніми в тканинах рослини в доступній для патогена формі; по-друге, мають бути відсутні токсичні для патогена з'єднання. Коло рослин, що вражаються даним патогеном, визначається тим, наскільки широкий круг поживних речовин, які він може перетворити в доступну форму, і здатністю фітопатогена до нейтралізації наявних в тканинах рослини токсичних речовин.
Розрізняють різні типи спеціалізації:
1) філогенетична спеціалізація – приуроченість паразита до деякого набору господарів певної таксономічної принадлежності, простіше кажучи – це спеціалізація по таксонам рослин-господарів. За філогенетичному принципом паразитів поділяють на поліфагів (вражаючих рослини з багатьох родин, порядків і навіть класів, істотно розрізняються за проходженням), монофагів (паразитують на рослинах однієї таксономічної групи – одного роду, декількох близьких родів або однієї родини) і олігофагія ( паразитують на рослинах у межах родини або філогенетично близьких родин) [22];
2) онтогенетична або стадійно-вікова (віково-фізіологічна) – пристосування фітопатогена до ураження рослин в певний період їх розвитку;
3) органотропічна спеціалізація – приуроченість фітопатогенів до певних органів рослин. Наприклад, розвиток одних паразитів відбувається на коренях, інших – на стеблах, третіх – переважно на плодах;
4) гістотропна або тканинна – приуроченість до визначеним тканинам;
5) фізіологічна спеціалізація – це здатність патогена заражати певні роди, види або життєві форми рослин, що розрізняються особливостями обміну речовин.
Нерідко спеціалізація буває пов'язана зі способами харчування. Так, біотрофи зазвичай зустрічаються серед моно- і олігофагів, некротрофи – серед оліго-і поліфагів. Не завжди спеціалізацію можна визначити однозначно. Наприклад, при вивченні органотропної спеціалізації необхідно розрізняти такі поняття, як зона зараження (частини рослини, в яких знаходиться паразит) і зона захворювання (на якій виявляються зовнішні симптоми хвороби). Ці зони можуть збігатися і не збігатися [22].


1.3. Типи патологічних змін у рослин, викликані бактеріями

Потрапляючи на рослинні тканини, фітопатогенні бактерії викликають патогенний процес, який супроводжується появою різних зовнішніх ознак (симптомів) ураження рослин. Ознаки ураження рослин бактеріозами досить різноманітні, хоч це різноманіття можна звести до декількох основних типів.
Перш за все розрізняють дві групи уражень: загальні і місцеві. Загальні ураження характеризуються ураженням всієї рослини, в якій бактеріальна інфекція поширюється в провідній системі, тобто по судинним пучкам і прилеглим до них тканинах. загальні бактеріози дуже шкідливі, адже вони спричинюють загибель рослини. Місцеве ураження обмежене місцем потрапляння бактерії в окремі органи чи їх частини, наприклад, листя, гілки, корені чи їх окремі ділянки. Місцеві бактеріози не приводять до загибелі рослини, хоча і приносять значну шкоду [7].
Розвиток патологічного процесу супроводжується появою на рослині ознак або симптомів хвороби. Кожному захворюванню притаманні свої характерні ознаки або симптоми, прояв яких залежить від умов навколишнього середовища. У зв'язку з цим розрізняють типові і нетипові для даного захворювання симптоми. Всі захворювання по симптомам, які проявляються можна віднести до кількох типів.
До одного з найбільш типових симптомів захворювання рослин відноситься розвиток гнилі. Загниванню можуть піддаватися всі частини рослини, але особливо ті, які багаті водою і запасними поживними речовинами (бульби, коренеплоди, цибулини), частіше при їх зберіганні. Причиною розвитку гнилей можуть бути і гриби, і бактерії. У випадку, коли під впливом ферментів патогена руйнується міжклітинна речовина і клітини розпадаються, кажуть про виникнення м'яких гнилей. Уражена тканина перетворюється на безформну масу різних кольорів. Гнилі можуть бути також мокрими, сухими і твердими. Мокрі гнилі утворюються в органах і тканинах, багатих водою. Сухі гнилі утворюється при руйнуванні міжклітинних речовин і оболонок клітин струм, відносно бідних на воду, тканини втрачають структуру і перетворюються в волокнисту або порошкоподібну масу. Прикладом розвитку гнилей такого типу є ураження деревини трутовиками. Відомі деякі типи захворювань, коли клітини відмирають без істотного руйнування пектину, тобто тверді гнилі [12]. Отже, гниль проявляється в пом’якшенні і розпаді окремих ділянок тканини або всієї ураженої рослини, що нерідко супроводжується неприємним запахом. Прикладом такого типу ураження є мокра гниль рослин (Pectobacterium carotovorum Dowson.), мокра гниль картоплі(Pseudomonas xanthochlora Stapp.) [1].
Плямистості або некрози виявляються у вигляді ділянок відмерлої тканини на уражених органах рослини – листі, стовбурах, плодах. Плями можуть мати різну форму: округлу, подовжену, незграбну. На листках форма некротичних плям залежить від розташування жилок. При ураженнях жилок некрози виявляються у вигляді штрихів. Дуже часто некрози чітко обмежені від здорової тканини і збудник локалізована в такій ураженій ділянці. Таке обмеження поширення збудника можна розглядати як захисну реакцію рослини. В інших випадках некрози рясно заселені патогеном, уражена тканина велика і добре помітна. При деяких ураженнях на межі здорової та ураженої тканини утворюється закорковілий шар, уражені ділянки втрачають зв'язок зі здоровими і випадають. Такий тип ураження називається дірчастою плямистістю [13]. Бактеріальні плямистості зустрічаються майже на всіх надземних органах рослин і відрізняються від плямистостей грибкового походження відсутністю споро ношень, а також наявністю світлої, блідо-зеленої облямівки [2]. Ураження типу плямистостей характерні для мікозів, бактеріозів і вірозів.
Виразки (антракнози) виникають при ураженні насичених водою органів і тканин рослин, і характеризуються розм'якшенням тканин, що оточують місця зараження. В результаті утворюються поглиблення, в яких відбувається спороношення паразита. Розвиток виразок можна розглядати як один з випадків плямистостей.
Хлороз і мозаїки виникають через порушення пігментації листків. При хлорозах це стосується загального пожовтіння або посвітління листя, при мозаїках пожовтіння зачіпає окремі частини листа. Частіше всього причинами цього бувають порушення живлення або ураження вірусами.
В'янення, або вілт – широко поширений тип ураження рослин, загибель яких відбувається в результаті проникнення збудників в кореневу і провідну системи. Спостерігається закупорювання провідних судин, під дією токсинів, що утворюються, відбувається некроз стінок. В результаті порушується транспорт води в рослині і вона в'яне. Причиною розвитку вілту можуть бути і гриби, і бактерії. У разі грибної інфекції в'янення називається трахеомікоз, в разі бактеріальної – трахеобактеріозом. Однак в'янення може бути пов'язано і з несприятливими умовами навколишнього середовища [9]. В'янення характеризується втратаю тургору рослинними клітинами, в’яненням всієї рослини чи окремих її частин (гілок, листя), інколи супроводжується потемнінням жилок на листі. Цей тип ураження зустрічається при в’яненні табака, томатів та інших пасльонових, що викликаються Pseudomonas solanacearum E. Sm., при в’яненні огірків та інших гарбузових (Erwinia tracheifilum Burgw.), в’яненні кукурудзи (Aplanobacter stewartii McCul). До них також відноситься судинний бактеріоз капусти, при якому характерне почорніння жилок (Xantomonas campestris Dowson.) [9].
Пухлини, або нарости виявляються як розростання ураженої тканини під впливом збудника хвороби. Можуть утворюватися на різних частинах рослини: на коренях (кила капусти), бульбах (рак картоплі), коренеплодах (рак кореня буряків). Виникнення наростів відбувається в результаті збільшення розмірів уражених клітин (гіпертрофія), або їх кількості (гіперплазія). Іноді обидва процеси протікають одночасно. Ураження такого типу свідчать про те, що патогени виділяють гормональні речовини, здатні порушити притаманний рослині спосіб зростання, привести до розростання окремих тканин. Нарости, галли, пухлини – характерні ознаки хвороб, що викликаються грибами, бактеріями і вірусами [8].
Наліт з'являються на поверхні уражених органів і являють собою міцелій і спороношення збудника хвороби – гриба. Особливості нальоту – забарвлення і розташування – можуть служити діагностичними ознаками збудника, наприклад, справжні та несправжньої борошнистої роси.
Пустули являють собою ділянки ураженої тканини з ознаками спороношення грибів, спочатку прикриті епідермісом, який згодом руйнується і розривається. Утворення пустул є найбільш типовою ознакою ураження іржистими грибами [10].
Парша – захворювавння, що розвивається на покривних тканинах, що приводить до їх розтріскування і утворення струпів. Зазвичай збудник захворювання не проникає глибоко всередину тканини, але при сильному ураженні може викликати деформацію плодів. Зустрічається парша на бульбах картоплі, плодах, насінні [8].
Муміфікація виражається в почорніння і ссиханні уражених органів рослини. Найчастіше муміфікуються уражені міцелієм паразитуючого гриба багаті поживними речовинами органи. Вражений плід перетворюється в тверде утворення – склероцій, покривні тканини якого темнозабарвлені. Характерні приклади таких уражень – ріжки злаків, муміфікація плодів яблуні.
Сажка проявляється в руйнуванні і перетворенні уражених органів і тканин рослини в чорну щільну або порошисту масу, що складається зі спор паразита, що утворюються на генеративних органах рослини: колосі, зернівці та інших [8].
Відставання в рості може бути пов'язане з хворобами як місцевого, так і загального характеру. Спостерігається зазвичай у вигляді дуже сильної інфекції і не є симптомом, характерним для будь-якого конкретного захворювання. Розростання пов'язано з надмірним ростом рослини за рахунок виділення патогеном ростових речовин. З надмірним виділенням ростових речовин пов'язана також і надмірна кущистість. В цьому випадку утворюється велика кількість стебел, такі рослини називають «відьмині мітли». На такий процес витрачається багато енергії, рослини погано плодоносять, мають дрібні листки і тонкі пагони. Вважають, що часто цей симптом є ознакою вірусного ураження.
Деформації представляють собою зміни форми ураженого органу. Наприклад, деякі грибні та вірусні хвороби пов'язані з деформаціями листя: скручуванням, зморшкуватістю, курчавістю. Скручування листя є результатом їх переповнення крохмалем (в результаті порушення його відтоку при ураженні провідної системи). Зморшкуватість і курчавість проявляються внаслідок нерівномірного росту мезофіла і жилок, а ниткоподібного – в результаті зростання тільки жилок. Деформації квіток – проліферації, махровість – є результатом вірусних уражень [2].
При бактеріальному опіку пошкоджуються всі надземні частини дерева: бруньки, квіти, листя, пагони, гілки. Захворювання починається з суцвіть, а потім переходить на пагони і гілки. Бруньки не розкриваються, чорніють і засихають, але не опадають. Квітки навесні раптово чорніють і в'януть, залишаючись на дереві. Молоді гілочки і листя починає чорніти з кінчиків, потім скручуються і інфекція швидко поширюється вниз по дереву. Листя буріють і чорніють, але не опадають, залишаючись на дереві протягом усього періоду вегетації. Дерево справляє враження обпаленого вогнем [6]. До цього захворювання належать бактеріальні опіки пагонів груші – Erwinia amylovora Burill., опік слив та інших кісточкових плодових дерев – Pseudomonas cerasi Griff.
Не завжди вказані типи ураження бактеріозами проявляються чітко. Деякі фітопатогенні бактерії при ураженні однієї і тієї ж рослини викликають не один, а кілька типів ураження. Наприклад, бактеріальний рак томатів – Corynebacterium michiganens Jens. може проявлятися у в’яненні рослин, розтріскуванні стебел і плямистості плодів. Опік плодових дерев – Erwinia amylovora Burill. – в ураженні кори, а також у в’яненні квітів та відмиранні бруньок [8].


1.4. Взаємовідносини фітопатогенних бактерій з рослинами-господарями та зовнішнім середовищем

Виникнення інфекційного процесу пов'язане не тільки з впливом на рослину патогенного мікроорганізму або іншого патогенного фактора. Сама рослина, як живий організм зі складним комплексом безперервно протікаючих фізіологічних процесів, не залишається байдужим до впровадження паразита, а протидіє йому. В результаті інфекційне захворювання представляється складним процесом, розвиток якого визначається двома протилежними засадами, що діють в єдності і в взаємозумовленості. Одна з таких засад – заселення патогенного мікроорганізму або іншого хвороботворного фактора, що викликає хворобу рослини; інша – протидія з боку рослини, тобто його реакція, яка виникає під впливом фітопатогенного фактора. Складні взаємини між рослиною і паразитом характеризують собою весь інфекційний процес і нерідко визначає результат захворювання [3].
У свою чергу інфекційний процес і взаємодіючі компоненти в великій мірі залежать від зовнішніх умов, в яких росте хвора рослина. Зовнішні умови, зумовлені навколишнім середовищем або виникають в результаті догляду за рослиною, дуже впливають на збудника інфекційного процесу, на рослину-господаря і на взаємини між ними. Таким чином, звичайно розвиток інфекційного захворювання визначається характером взаємовідносин трьох компонентів:
1) патогенного мікроорганізму – збудника хвороби,
2) рослини-господаря,
3) зовнішнього середовища, в якій протікає інфекційний процес [2].
З трьох названих компонентів найбільший вплив на виникнення і розвиток захворювання мають умови зовнішнього середовища. Зовнішнє середовище впливає на стан рослин і характер їх реакції на шкідливий вплив паразитів – збудників хвороб. Фактори зовнішнього середовища при певному їх поєднання можуть значно посилювати чи послаблювати опірність рослин до окремих хвороб.
Основні фази інфекційного процесу. Інфекційні хвороби рослині характеризуються більш-менш тривалим патологічним процесом, в якому окреслюються різні моменти або етапи, що послідовно проходять у певній закономірності. Більшість інфекційних хвороб рослині проходять наступні фази або стадії.
1. Зараження, при якому спори паразитичних грибів або інший інфекційний початок приходить в контакт з рослиною.
2. Інкубація або інкубаційний період, що охоплює ряд процесів між зараженням і появою перших ознак хвороби.
3. Власне захворювання - поява будь-якої хвороби в полі саду, з певними реакціями і симптомами натому чи іншому органі рослини [8].
Рослини мають певні механізми, які протидіють зараженню і розмноженню в них фітопатогенів. Основним з них є наявність щільного поверхневого бар'єру у рослин. Кутикула, що покриває епідерміс всіх наземних стебел і листя трав'янистих рослин, забезпечує практично повний захист від фітопатогенних бактерій. Тому найчастіше проникнення фітопатогенів відбувається через уражені ділянки (рис.1.1).
Захисним механізмом рослин є і виділення клітинного соку, що має кислу реакцію. Рослини також продукують речовини, що пригнічують або гальмують зростання фітопатогенів. Найбільш активними з них є феноли. У тканинах рослин феноли зустрічаються у вигляді ефірів і глікозидів. Це пірокатехін, гідрохінон, фенольні спирти, альдегіди і кислоти.
Важливе значення в стійкості рослин до ураження бактеріями мають і фітонциди – речовини різної хімічної природи, летючі або розчинені в цитоплазмі клітин рослини, що мають широку антибіотичну дію [14].
У розвитку стійкості рослин до захворювань велике значення мають фітоалексини, які утворюються в рослині лише в процесі захворювання, тобто при потраплянні в або контакті мікроорганізму з клітинами рослини. Прикладом фітоалексинів є ришитіп, що синтезується в бульбах картоплі, стримуючий поширення «мокрою» гнилі та зменшує ураження [13].
Фітопатогенні мікроорганізми завдають великої шкоди сільському господарству, викликаючи зниження врожаю і погіршення його якості. Серед захворювань рослин майже половину становлять бактеріози. В даний час відомо понад 200 економічно важливих хвороб рослин, які викликаються бактеріальними збудниками.
Для боротьби з хворобами рослин проводяться наступні заходи:
виведення нових стійких сортів;
чергування сільськогосподарських культур у розрахунку на те, що спеціалізовані паразити при тривалому знаходженні в грунті без рослини-господаря гинуть;
карантинні заходи – контроль за якістю насіння, особливо імпортного;
застосування отрутохімікатів для знищення хвороботворних мік-роорганізмів;
використання мікробів-антагоністів або препаратів антибіотиків;
підвищення стійкості рослин шляхом застосування мікроелементів;
видалення з рослини уражених місць; викорчовування хворих дерев і т.д.;














Рис. 1.1. Способи проникнення інфекції, розмноження фітопатогенних бактерій і типи симптомів, що викликаються ними [19]

застосування здорового посадкового матеріалу (бульби, кореневища і т.д.);
боротьба з переносниками бактерій. Якщо комахи є переносниками бактерій або полегшують їх проникнення в рослини (наприклад, листові попелиці), боротьба з ними може істотно стримати поширення хвороби[5].


1.5. Розповсюдження фітопатогенних бактерій

Виникнення бактеріальних хвороб у певній місцевості вперше в сезоні (первинна інфекція) обумовлено головним чином наявністю збеженої бактеріальної інфекції, а поширення бактеріозів протягом вегетаційного періоду (вторинна інфекція) здійснюється різними природними і штучними чинниками [3].
Бактеріальна інфекція може зберігатися різними способами, але найбільше значення мають насіння і посадковий матеріал, живі рослини і рослинні залишки, комахи і грунт [10].
Насіння та посадковий матеріал. Насіння, бульби та іншої посдкових матеріал є найбільш поширеним місцем збереження фітопатогенних бактерій і джерелом зараження рослин бактеріозами. Насіння може служити джерелом появи будь-якого бактеріозу там, де його раніше не було, тобто вони можуть бути розповсюджувачами хвороб по земній кулі. З насінням був занесений збудник гоммоза бавовнику – Xanthomonas malvacearum Dowson. в бавовносіючі райони, де це захворювання раніше не зустрічалося. Бактерії можуть знаходитися як на поверхні насіння, куди потрапляють при обмолоті (наприклад, коробочок тютюну Pseudomonas tabaci Stapp.) і витяганні насіння з органів плодоношення (наприклад, плодів томатів при зараженні чорною плямистістю Xanthomonas vesicatoria Dowson.), так і у внутрішніх їх тканинах, куди потрапляють ще під час росту рослин. Наприклад, збудник бактеріоза квасолі –Xanthomonas phaseoli Dowson. передається з бобів па насіння [9].
Зараження рослин від заражених насіння відбувається різноманітними шляхами: просуванням бактерій по судинах пагонів (чорний бактеріоз пшениці – Xanthomonas translucens Dowson, кільцева гниль картоплі –Coryпеbacterium sepedonicum Scapt. Et Burch); винесенням бактерій з сім'ядолями, які хворіють і служать джерелом інфекції листя і їх ураження (гоммоз бавовнику – Xanthomonas malvacearum Dowson.); винесенням насіннєвої оболонки на поверхню грунту при появі сходів і перенесення бактерій на листя рослин, викликаючи їх зараження (бактеріальна рябуха абака – Pseudomonas tabaci Stapp.) [9].
Рослинні залишки. Мертві залишки хворих рослин - одне з основних місць збереження бактерій і джерело зараження здорових рослин бактеріозами. Так зберігаються багато фітопатогенні бактерії. Тому рослинні залишки (опале листя, сухі гілки і ін.) повинні обов'язково знищуватися. Фітопатогенні бактерії можуть зберігатися і в живих рослинах, наприклад при бактеріозі деревних порід [8].
Комахи. Деякі види фітопатогенних бактерій перезимовують в комах, які можуть служити джерелом первинної інфекції рослин навесні. Це доведено для збудника в’янення огірків – Erwinia tracheifila (Sm.) Holl., зимуючої в кишечнику деяких жуків-листоїдів (Diabrotia vittata). Тут збудник хвороби повністю залежить від жука-листоїда і боротьба з ним односильна боротьбі з самою хворобою. Комахи для багатьох видів фітопатогенних бактерій служать найголовнішими агентами поширенняня. Вони відіграють важливу роль в розповсюдженні збудника чорної ніжки картоплі – Pectobacterium phyiophthorum Dowson. Наприклад, паросткова муха (Hytemya trichodactyla) є місцем збереження збудника, який потім служить джерелом зараження картоплі. Опік яблунь, груш та інших плодових дерев - Pseudomonas cerasi Griff., поширюється в саду за участю бджіл і ос, на яких вперше доведена можливість перенесення комахами бактеріоза. Бактеріальне в'янення кукурудзи (Aplanobacter stewarii McCul.) передається стебловими жуками Chaetocnema pulicoria і Ch. denticulata, а також личинками жуків Djabrotica dtiodecempunctata. Хлібний клоп поширює бактеріоз качанів кукурудзи – Bacillus mesentericus vulgatus Flьgge [10].
Грунт. До недавнього часу грунт вважалася одним з основних місць збереження та накопичення бактеріальної інфекції. В даний час встановлено, що більшість фітопатогенних бактерій в грунті дуже швидко гине. Загибель їх викликається грунтовими мікроорганізмами-антагоністами або бактеріофагами. Тому грунт якщо і служить джерелом зараження рослин бактеріозами, то лише на дуже короткий термін (не більше 10-15 днів). У той же час в ризосфері коренів можуть зберігатися фітопатогенні бактерії, що, ймовірно, пояснюється меншою кількістю їх антагоністів в різосфері, ніж у грунті. На коренях озимих доведена можливість зимівлі збудника бактеріальної рябухи тютюну – Pseudomonas tabaci Stapp. і чорної плямистості томатів – Xanthomonas vesicatoria Dowson. [8].
Поширення фітопатогенних бактерій з хворих рослин на здорові і від місця первинної інфекції одного району в інший може відбуватися як за допомогою різних природних чинників-повітря, води, комах, так і штучним занесенням інфекції в результаті господарської діяльності людини [3].
Повітряні течії. Мікроскопічно малі бактерії і найменшічастки хворих рослин поширюються також з допомогою руху повітря. Однак більшість фітопатологичних бактерій безспорові і досить швидко гинуть в сухому повітрі і від впливу прямих сонячних променів [8].
Вода. У поширенні бактерій вода має велике значення. Краплі дощу потрапляють на землю або хворі рослини і з бризками води інфекція переноситься на здорові рослини. Поширенню бактеріозу сприяють такі поливні води і течії річок, коли у воду потрапляють залишки хворих рослин. Прикладом такого перенесення може служити поширення гоммоза бавовнику –Xanthomonas matvacearum Dowson. з аричними водами.
В процесі обробітку сільськогосподарських культур людина також може бути розповсюджувачем деяких бактеріозів. Наприклад, при пасинкуванні томатів від однієї рослини до іншого переноситься бактеріальний рак томатів – Corynebacteriu michiganense Jens [3].
При введенні в культуру важливих в економічному відношенні і врожайних рослин, а також при перевезенні рослин з однієї країни в іншу (пшениця, кукурудза, картопля, тютюн тощо) завозилися і різні збудники хвороб. При цьому вони виявлялися в найбільш сприятливих умовах, так як культури, які вони вражали, були сприйнятливі до цієї хвороби.
Наприклад, збудник раку цитрусових – Xanthomonas citri Dowson. в 1911 р. був завезений з Японії до Флориди. В Японії цей бактеріоз не заподіював шкоди, а у Флориді виявився настільки небезпечним, що для викорінення хвороби довелося знищити 15 млн. дерев у розсадниках і на плантаціях. Це коштувало величезних грошових витрат, що обчислюються мільйонами доларів. Збудник бактеріального опіку плодових – Pseudomonas cerasi Griff., виявлений в Північнії Америці ще в 1870 р., був перенесений приблизно в 1911 р. в Японію, в 1919 р. – до Нової Зеландії і в 1924 р. – до Італії, а потім хвороба поширилася і в інших країнах. У нас хвороба зустрічється на абрикосах, сливах і персиках [10].


1.6. Біологія фітопатогенних бактерій

Систематика фітопатогенних бактерій. Відповідно до сучасної класифікації бактерій фітопатогенні види перебувають в наступних таксонах.
1 . Відділ Firmicutes (грампозитивні ).
Рід Bacillus – рухливі, спороутворюючі, з перитрихіальними джгутиками. Наприклад, Bacillus pumilus Meyeret. Gottheil. – збудник бактеріальної плямистості листя буряка.
Рід Clavibacter (синонім - Corynebacterium) – нерухомі бактерії, що утворюють ланцюжки. Найбільш шкідливі види: С. michiganensissub sp. michiganensis (Smith.) Davisetal. – збудник бактеріального раку томата; С. michiganensissub sp. sepedonicus ( Spieckermannet Kotthoff.) Daviseta – збудник кільцевої гнилі картоплі.
Рід Streptomyces. Формують тонкий розгалужений міцелі зі спорами. З шкідливих видів слід зазначити Streptomyces scabiei Lambertet Loria – збудника звичайної парші картоплі.
Клас Mollicutes. До цього класу належать фітоплазми.
2 . Відділ Proteobacteria (грамнегативні).
Родина Enterobacteriaceae. Рухливі, з перитрихіальними джгутиками, факультативні аероби.
Рід Erwinia. Викликають некрози і в'янення. Найбільш шкідливий вид - Е. amylovora (Burrill.) Winsl. Etal. – збудник бактеріального опіку плодових.
Рід Pectobacterium. Викликають некрози і мокрі гнилі різних рослин. Найбільш шкідливі збудники хвороб: P. carotovorumsub sp. carotovorum (van Hall.) Hauben. – викликає мокру гниль бульб картоплі та слизовий бактеріоз капусти; P. carotovorumsub sp . atrosepticum (Jones.) Hauben. – викликає чорну ніжку картоплі.
Рід Pantoae. Викликають листові плямистості, розростання рослини і інші ураження. Найбільш значущий вид – Pantoea stewartii subsp. stewartii (Smith) Mergaert et al – збудник бактеріального в'янення кукурудзи.
Родина Ralstoniaceae. Найбільш важливий в економічному відношенні вид – R. solanacearum (Smith) Yabuuchietal– збудник бурої гнилі картоплі і в'янення багатьох культур.
Родина Pseudomonadaceae. Грамнегативні рухливі палички з полярними джгутиками. Синтезують водорозчинний флуоресціюючий пігмент і різні токсини. Рід Pseudomonas включає близько 50 видів, багато з яких фітопатогенні. Найбільш шкідливі збудники хвороб рослин відносяться до виду Pseudomonas syringae : P. syringaepv .atrofaciens Stevens. – викликає бурий бактеріоз злаків; P. syringaepv. lachrymans (Sm.etBr.) Carsner – викликає незграбну плямистість листя огірка; P. syringaepv. Syringaevan Hall. – викликає листові плямистості багатьох видів рослин.
Родина Xanthomonadaceae. Бактерії роду Xanthomonas викликають захворювання більше 400 видів рослин. Синтезують жовтий пігмент. Найбільш шкідливі збудники хвороб: Xanthomonas campestris pv .campestris (Pammel) Dows. – викликає судинний бактеріоз капусти; X. translucens pv. translucens (Jonesetal.) Dye – викликає чорний бактеріоз пшениці.
Родина Burkholderiaceae. Один з найбільш шкідливих збудників хвороб – Burkholderia cepacia (Palleroniet Holmes.) – викликає бактеріоз цибулі та часнику.
Родина Rhizobiaceae. Грамнегативні, рухливі завдяки полярним жгутикам. Серед фітопатогенів найбільш відомий у зв'язку з високою шкідливістю вид Agrobacterium tumefaciens Sm. et Towns. – збудник кореневого раку плодових, винограду і раку коренеплодів буряка.
Рід Pseudomonas. Вперше псевдомонади були описані К. Флюгге в 1886 р. і названі ним Bacillus fluorescens. У 1894 р. був створений рід Pseudomonas. Розміри клітин бактерій 0,5-1 х 1,5-4 мкм. Всі представники рухливі. З джгутиками полярні (монополярні, амфітріхіальні, лофотріхіальні) [15].
Грамнегативні, аеробні, не утворюють спор, в більшості – хемоорганотрофні бактерії. Метаболізм дихальний, ніколи не бродильний. Зростають при температурі від 4 до 43 ° С. За морфології це прямі або зігнуті палички, що пересуваються за допомогою полярно розташованих джгутиків. У більшості випадків хемоорганотрофамі, але зустрічаються і хемолітоавтотрофи. Метаболізм суворо дихальний. Оксидазна реакція позитивна. Окремі представники здатні до денітрифікації.
Типовий вид – Pseudomonas aeruginosa [5].
Рід Xanthomonas. Відмінними ознаками від представників роду Pseudomonas є деякі особливості метаболізму, до числа яких відноситься здатність продукувати екстрацелюлярний полісахариди ксантан, а також жовті внутрішньоклітинні нерозчинні у воді пігменти ксантомонадіни, які представляють собою бромовані або метиловані арілполіени.
Оксидазна реакція негативна. Нітрати не відновлюють. Харчові потреби для росту складні, бактерії залежать від наявності в середовищі метіоніну, глутамінової та нікотинової кислот.
Всі представники роду Xanthomonas патогенні для рослин.
Типовий вид – Xanthomonas campestri [15].
Рід Erwinia та Pectobacterium. Erwinia рід бактерій родини Enterobacteriaceae; грамнегативні паличкоподібні бактерії, 1-3 мікрон завдовжки і 0,5-1 мікрон в діаметрі. Рухомі, мають численні джгутики (окрім Erwinia stewartii). Гетеротрофи, факультативні анаероби. Типовий вид Erwinia amylovora. Більшість представників роду асоційовані з рослинами, серед них є епіфіти, сапротрофи, фітопатогени [6].
Кілька видів роду були виділені у окремий рід Pectobacterium, що хоча і був ухвалений, перестав використовуватися в кінці 1990-тих років. В 1998 році Хаубен з співавторами знову запропонували відновити його на основі дослідження 16S рРНК, куди були віднесені E. carotovora (як P. carotovorum), E. cacticida, E. chrysanthemi, E. cypripedii (як P. cacticidum, P. chrysanthemi і P. cypripedii відповідно). Крім того, E. alni, E. nigrifluens, E. paradisiaca, E. quercina, E. rubrifaciens і E. salicis були винесені до нового роду Brenneria. Зараз, проте, залишаються сумніви щодо доцільності такого винесення і часто для спірних видів застосовуються обидва синоніми, а класифікація роду Erwinia та утворених з нього родів продовжує переглядатися. Зокрема було запропоновано надати ранг видів підвидам P. carotovorum (syn. E. carotovora) P. atrosepticum, P. betavasculorum і P. wasabiae, а P. chrysanthemi (syn. E. chrysanthemi) і Brenneria paradisiaca (syn. E. paradisiaca) перенести до роду Dickeya [14].
Оптимальна температура для росту бактерії родуErwinia дорівнює 27-30 ° С. Катаболізує глюкозу та інші вуглеводи з утворенням кислоти; газ більшість видів не утворюють. Нітрати більшість видів не відновлює. Як джерела кисню та енергії використовують ацетат, глюконат, малат, сукцинат і фумарат, але не бензоат, оксалат або пропіонат.
Рід Erwinia складається з 17 видів. Типовий вид – Erwinia amylovora (збудник бактеріального опіку плодових). Бактерії цього виду потребують для зростання нікотинову кислоту [10].
Представники роду Erwinia є паразитами, сапрофіти або складовою частиною епіфітна мікрофлори рослин. Фітопатогенні бактерії цього роду можуть викликати некрози, опіки і в'янення, а також типові «мокрі» або «м'які» гнилі, які відносяться до паренхіматозних, судинних і гіперплазичних захворювань. Наприклад, бактерії виду Е. ananas викликають гниль плодів ананасів; Е. caroіovorа – «м'яку» і «мокру» гниль запасних тканин у великої кількості рослин, а також «чорну ніжку» у вегетуючих рослин картоплі; Е. chrysanthemi – судинний вільт і некрози різних рослин, у тому числі хризантем; Е. cypripedii – коричневу гниль орхідей; Е. rhapontici – гниль ревеню і гіацинтів, псування зерна пшениці; Е. nigriЯuens – некрози волоського горіха; Е. Salicis – судинний вілт верб; Е. quercina – опік листя дубових.
Факторами патогенності фітопатогенних бактерій роду є пектолітіческіе, целюлолітіческіе ферменти, екзотоксини та слизові речовини полисахаридной природи [8].
Рід Clavibacter. Бактерії роду Clavibacter виділені з роду Соrуnеbасtеrium. Цей рід об'єднує види аеробних фітопатогенних бактерій, клітинна стінка яких містить 2,4-діаміномасляну кислоту, а не мезо-2-мінопімелінову, як у бактерій інших видів роду Соrуnеbасtеrium.
Крім того, в клітинній стінці бактерій Clavпbacter не містяться міколові кислоти і арабіногалактановий полімер [15].
Бактерії роду Clavпbacter представлені прямими або злегка зігнутими тонкими паличками (0,4-0,75 х 0,8-2,5 мкм) неправильної форми і часто клино- або булавовидний форми, переважно одиночними або в парах V-подібної конфігурації. У старих культурах виявляють кокоподібні клітини, але цикл «палички-коки» не характерний [5].
Грампозитив
·ні, нерухомі, неспороутворюючі, некислотостійкі. Бактерії роду Clavпbacter відносяться до облігатним аеробам і хемоорганотрофів. Метаболізм дихального типу з утворенням невеликої кількості кислоти з глюкози і деяких інших вуглеводів. Індол не утворюють, нітрати не відновлюють. Оптимальна температура для росту 20-29°С; в рідкісних випадках ростуть при температурі вище 35°С. Потребують багатих поживних середовищ, ростуть повільно. Деякі штами синтезують жовтий чи блакитний пігмент.
Бактерії роду Clavпbacter є облігатними паразитами, викликають захворювання різних квітучих рослин.
Рід Clavпbacter представлений п'ятьма видами: С. iraniens, С. michi-ganensis, С. rathayi, С. tritici, С. xylі. Типовий вид – С. michiganensis (збудник бактеріального раку томатів) [1].
Рід Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens грам-негативна облігатно аеробна паличковидна ґрунтова бактерія. На відміну від своїх родичів різобій, що є симбіонтами рослин, ця бактерія є відомим патогеном багатьох видів рослин, викликаючи хворобу корончастих галлів (типу рослинної пухлини). Через велике число видів рослин, які вона вражає (наприклад, виноград, хрін, цукровий буряк, ревінь), є важливою загрозою для сільського господарства [1]. Крім того, вона може бути опортуністичним патогеном деяких тварин, зокрема людини [2]. Головний фактором патогенності є здатність цієї бактерії трансформувати клітини рослини-хазяїна за допомогою спеціальної плазміди. Через цю властивість Agrobacterium tumefaciens широко використовується в генній інженерії для трансформації рослин.
A. tumefaciens викликає утворення так званих корончатих галлів у рослин. Це пухлиноутворення пов'язане з перенесенням Т-ДНК в геном рослини з подальшою його трансформацією. Трансформовані клітини, зважаючи на дисбаланс синтезу фітогормонов, дедиференціюються і починають неврегульоване зростання. Також трансформовані клітини рослини починають синтезувати опіни, які A. tumefaciens здатна використовувати як джерело живлення. Певну роль в індукції експресії генів вірулентності A. tumefaciens з рослиною-господарем грають специфічні внутріклітинні метаболіти рослини-хазяїна [15], що виділяються при пораненні тканин рослини. Важливим етапом патогенного процесу є синтез Т-ворсинок при допомозі системи секреції IV типу, що здійснюється під дією VIRB-оперону. За допомогою Т-ворсинок A. tumefaciens приєднується до клітини рослини, формуючи кон'югаційний місток і за допомогою білка VirE1 переносить комплекс одноланцюжкової Т-ДНК з білком VirE2 (що утворюється заздалегідь з Ti плазміди і сполученого з білком VirE2) в клітину рослини. Також на трансформацію клітин рослин робить вплив специфічний білок VirE3, що транспортується в ядро разом з Т-ДНК і що ймовірно зв'язується з фактором транскрипції. У ядрі Т-ДНК інтегрується в геном клітини рослини-хазяїна шляхом сайт-специфічної рекомбінації. Впровадження Т-ДНК викликає утворення характерних пухлин рослин через гіперсинтез фітогормонів, у пухлинних тканинах починають накопичуватися опіни [12].
Рід Bacillus. До роду Bacillus відносяться аеробні або факультативно-анаеробні паличкоподібні бактерії, більшість з них рухливі. Хемоорганотрофи. Метаболізм суворо дихальний, суворо бродильний або дихальний і бродильний одночасно, з використанням різних субстратів. Деякі представники здатні отримувати енергію за рахунок нітратного дихання. Для більшості представників роду Bacillus характерно бродіння з утворенням 2,3-бутандіолу, гліцерину та СО2, а також невеликих кількостей молочної кислоти та етанолу. Бутандіолове бродіння, здійснюване бактеріями роду Bacillus, можна представити таким чином:
3Глюкоза
· 2 (2,3-бутандіол) + 2 гліцерин + 4 СО2 [15].
Більшість представників роду Bacillus є сапрофіти, широко поширені в природі, особливо в грунтах, багатих органічними речовинами (В. subtilіs, В. megaterium, В. pofymyxa, В. stearother-mophilus, В. licheniformis). В. megaterium вважаються «гігантами» серед еубактерій, так як їх клітини мають розміри 2x5 мкм. Вид В. subtilis є типовим для роду Bacillus, називається «сінної паличкою» (так як накопичувальні культури даних бактерій отримують з настою сіна). Бактерії В. pofymyxa отримали назву через те, що вони утворюють велику кількість слизу. В. stearothermophilus – виражений термофіл (температурний оптимум для росту 50-65°С).
Бактерії роду Bacillus є активними продуцентами різних антибіотичних речовин. В даний час відомо близько 200 антибиотиків, синтезованих цими бактеріями [2].


1.7. Фітопатогенні мікоплазми

Роль мікоплазм як збудників захворювань рослин була вперше доведена в 1967 році при проведенні електронномікроскопіческом аналізу деяких уражених рослин. До цього часу часто плутали захворювання, що викликаються вірусами та мікоплазмами через подібність симптомів. Однак у розвитку таких захворювань існує ряд відмінностей:
1) мікоплазми переносяться тільки комахами (головним чином цикадки), а період їх інкубації і розмноження в переноснику досить тривалий: від 2 тижнів до 1,5 місяців. Видове різноманіття для кожного збудника досить широко і практично відповідає колу живлять переносника рослин;
2) збудники термолабільні як в рослині, так і в переноснику і підвищенням температури можна добитися їх атенуації;
3) інокуляція соком хворої рослини стерильною особини комахи переносника призводить до зараження останнього, при цьому в тканини переносника з'являються частинки, що перевершують за розмірами відомі віруси[10].
Фітопатогенні представники виявляються в трьох родинах мікоплазм: Acholeplasma, Mycoplasma, Spiroplasma.
В даний час відомо більше 200 видів рослин з 59 родин, що вражаються мікоплазмами. Спільним для цих захворювань є поширення їх в зонах з помірним і теплим кліматом, сприятливим розвитку сисних комах - основних переносників. Найбільш шкідливими мікоплазмоз вважаються мікоплазмоз пшениці, пасльонових, винограду та деяких деревних культур. Мікоплазмоз відносяться до захворювань катастрофічним, часто приймають характер епіфітотій. Урожай пшениці може знижуватися на 80-90%, томатів – на 25-35%, картоплі - до 20% [14].
При заселенні мікоплазмами провідної системи рослин і виділення ними продуктів життєдіяльності зазвичай відбувається посилене утворення дегенеративних клітин флоеми, в результаті хворі рослини стають карликовими, жовтушними і в'януть. Відомі й прямо протилежні випадки – айстри і тютюн, заражені мікоплазмами, живуть набагато довше, так як у них затримується початок репродукції рослин. Зазвичай в уражених мікоплазмами рослинах порушуються процеси регуляції росту і змінюється габітус – утворюються в надлишку додаткові бруньки і пагони, порушується домінування верхівки. Рослини набувають вигляду «відьминої мітли» через утворення додаткових бічних пагонів. У них зменшується розмір міжвузлів (карликовість), листя, змінюються генеративні органи, що призводить до безпліддя. Після ураження припиняється плодоношення [12].
Першими ознаками жовтухи є просвітлення судин інфікованого листка, який поступово втрачає зелене забарвлення, процес пожовтіння поширюється і на інші листки, тобто жовтуха – системне захворювання.
З 40 найбільш відомих мікоплазмозів пасльонових самими шкідливими вважаються «відьмині мітли» картоплі та столбур томатів. В уражених рослин картоплі утворюється безліч тонких стебел, дрібних бульб, які проростають розгалуженими пагонами. Мікоплазми виявляються у флоемі і ситовидних трубках стебел і листя. При столбурі томатів через 20-30 діб після інфікування листя стає хлоротичними, краї їх піднімаються. Мікоплазми зазвичай виявляються в ситовидних трубках, вкрай рідко в клітинах мезофілла або кореня. Кількість клітин мікоплазм в одній рослинної досягає 100 [10].
Найбільш простим способом діагностики мікроплазмозів є обробка хворих рослин антибіотиками тетрациклінового ряду. Якщо після такої обробки рослина одужує, то роблять висновок про мікоплазменну природу захворювання. Для рослин, що знаходяться на останніх стадіях вегетації, такий спосіб є неефективним. У даному випадку можливе використання електронної мікроскопії або інших мікроскопічних методів з подальшим фарбуванням зрізів.
У зв'язку з тим, що мікоплазми дуже важко культивуються і виділяються в чисту культуру, для доведення їх патогенних властивостей використовують наступний прийом: соком хворих рослин заражають стерильних комах-переносників, а потім згодовують їм здорові рослини. Оскільки різні збудники можуть індукувати на рослинах подібні симптоми, для ідентифікації можуть використовуватися і індикаторні рослини. В якості таких індикаторних рослин використовуються барвінок, певні сорти томатів, тютюну та ін. Різні форми захворювань проявляються на індикаторних рослинах по-різному, залежно від видової приналежності збудника [11].
При визначенні видової приналежності мікоплазм використовують серологічні методи, а також методи, засновані на дослідженні їх унікальних властивостей: потреби в стеринах, здатності до гідролізу сечовини, синтезу каротиноїдів.
Мікоплазми можуть мати як специфічних, так і неспецифічних хазяїв. При дослідженні особливостей їх поведінки і в тих, і в інших, виявилося, що розмноження і зростання відбувається по-різному в клітинах специфічних або неспецифічних хазяїв. Звичайним місцем їх проживання є ситовидні елементи флоеми хворих рослин. Кількість клітин мікоплазм коливається від кількох до повного заповнення об'єму рослинної клітини. Часто мікоплазми розташовуються вздовж цитоплазматичної мембрани [10].
Ймовірно, за ступенем прояву такого симптому як хлоротичність листя і визначається кількістю клітин мікоплазм. Коли їх небагато, то транспорт пластичних речовин відбувається відносно нормально, якщо мікоплазм багато, то закупорюються судини і хлоротичність листя виражена сильніше [11].
На специфічних рослинах-господарях взаємодія мікоплазм з їх клітинами відбувається в три етапи:
1-ий етап. Проникнення мікоплазм в молоді паренхіматозні клітини флоеми, де вони взаємодіють з мембранними елементами клітини. Реакція клітини-господаря проявляється в утворенні окремих виростів мембрани, спрямованих у бік клітин мікоплазм. Мембранні структури рослинних клітин розбухають і зливаються з мембранними структурами мікоплазм.
2-й етап. Подальший розвиток інфекції характеризується порушенням нормального метаболізму рослинної клітини. На 3-4 добу цитоплазма інфікованих молодих клітин темніє від насичення рибосомами і полісомії, що свідчить про посилення метаболізму уражених клітин.
3-й етап. У хлоропластах міститься підвищена кількість крохмалю, що призводить до розвитку хлорозу і руйнування клітин [10].
У клітинах неспецифічних рослин-господарів подібні явища не спостерігаються, мікоплазми в таких клітинах не виявляють тропізму до мембран рослинних клітин. Передбачається, що при адсорбції на мембранних елементах клітин-господарів мікоплазми отримують можливість брати з них необхідні живильні субстрати (жирні кислоти, холестерин) [14].
Вважається, що основні чинники патогенності у більшості мікоплазм ті ж, що і у інших бактерій, за винятком тих, які визначаються наявністю клітинної стінки. До числа найбільш часто зустрічаються у мікоплазм факторів патогенності можна віднести продукцію фітотоксинів і ферментів. Spiroplasma citri утворює два типи токсинів, які викликають в'янення рослин і затримують проростання насіння. Одним з факторів патогенності можна також вважати конкуренцію мікоплазм з рослинами-господарями за певні продукти метаболізму (цукру, амінокислоти) [6].



РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ


Рослинний матеріал для досліджень відбирали у багаторічних насадженнях Закарпатської області протягом 2010 – 2014 рр. Відбір зразків із симптомами бактеріального ураження органів дерев проводили в різні періоди вегетації – навесні (період цвітіння), влітку (інтенсивний ріст пагонів) та восени.
Виділення патогена. Висновок про природу патогена не можна зробити виходячи тільки з симптомів захворювання. Одні й ті ж або подібні симптоми можуть бути викликані видами мікроорганізмів, які часто дуже далекі один від одного в систематичному відношенні. Майже однотипні симптоми спостерігаються, наприклад, при бактеріозах квасолі, викликаних трьома різними організмами (Р.phaseolicola, Х.phaseoli і Х.рhаseolivar. fuscans). При встановленні діагнозу хвороби недостатньо одного лише уявлення про характер її симптомів. Для цього необхідно виділити і ідентифікувати збудника, і переконатися в патогенних властивостях ізольованої культури [19].
Найбільш доцільно дотримуватись постулатів Коха, які з невеликими змінами можуть бути використані при вивченні фітопатогепних мікроорганізмів.
1. Встановити наявність бактерії в ураженій тканині рослини після її мікроскопування.
2. Виділити бактерії в чисту культуру.
3. Провести зараження сприйнятливої рослини-хазяїна з метою одержання вихідних симптомів.
4 . Реізолювати бактерії з інокульованої тканини.
5. Порівняти вихідну і реізольовану бактеріальну культури і ідентифікувати бактерії.
При зборі зараженого матеріалу необхідно вжити заходів для подальшого успішного виділення бактерій. З практики добре відомо, що рослини, взяті з полів для дослідження причини їх захворювання, зазвичай сильно вражені. Виділення патогена з таких рослин досить складне або взагалі неможливе через заселення їх тканин вторинною сапрофітною мікрофлорою. Бактерії можна виділити значно успішніше зі свіжого рослинного матеріалу, на якому є первинні симптоми ураження. Мішечки з пластику непридатні для транспортування і зберігання уражених матеріалів через небезпеку розмноження в закритому і вологому середовищі постійно присутніх на матеріалі сапрофітів. Сухий матеріал більш придатний для виділення збудника, ніж вологий. Зразка для лабораторних досліджень слід перевозити і зберігати між двома шарами паперу [19].
У процесі вивчення уражених листків не рекомендується використовувати хімічні засоби для їх поверхневої стерилізації, так як ці речовини можуть легко дифундувати в тканині листа і вбити бактеріальні клітини. Для поверхневої дезінфекції матеріалу найбільш підходящим є розчин гіпохлоріта або іншого дезінфектанта. Найбільш поширений метод занурення матеріалу в 0,5 %-вий розчин хлорокса (Nа-гіпохлорита, розчин 1:9) на 2 хвилини, після чого матеріал ретельно промивають дистильованою водою і продовжують вивчення. При дослідженні листя найкраще промити їх поверхню проточною водопровідною водою.
Процес виділення збудника хвороби з листя полягає в наступному: частини ураженого листка разом зі здоровою тканиною вирізають стерильним ножем і поміщають на поверхню передметного скла, попередньо простерилізованого в полум'ї горілки. На поверхню предметного скла наносять одну краплю стерильної водопровідної або пептонної води і гострою бритвою роблять кілька зрізів листа в області ураження. Через 1-2 хв. бактерії почнуть дифундувати з ураженої тканини в пептонну воду. Препарат покривають покривним склом і вивчають під мікроскопом при збільшенні не менше 400 разів. Найкраще працювати із збільшенням 800-1500 разів [19].
На місці зрізу можна спостерігати невелику хмарку бактерій, що дифундують з пораженої тканини в зовнішнє середовище. Для їх детального розгляду можна використовувати масляну іммерсію або фазовий контраст. Опис цих методів можна знайти в будь-якому керівництві по мікробіології.
Можливість використовувати зрізи особливо важлива при вивченні уражень судинних пучків, захворювань стебла і провідних судин, коли досліджують ту частину, на якій помітні первісні симптоми захворювання. Уражені стебла ріжуть на частини довжиною 3-4 см, розщеплюють в довжину, і судинні пучки мацеруються. З більш мясистих стебел, коріння або бульб бактерії легко виділяють, здавивши пальцями уражені тканини так, щоб бактерії вийшли назовні разом з соком.
З пухлин і тканин ксилеми бактерії виділяють таким чином: невеликий шматочок ксилеми, промитої з поверхні, занурюють у спирт і підпалюють його. Спирт горить 1-2 сек., після чого поверхність стає стерильною. Для поверхневої стерилізації можна використовувати також 0,5%-вий розчин Хлорокса. Бактеріальний препарат з мацерованої знебарвленої тканини або живої тканини готовий для дослідження.
Аналогічні методи стерилізації та виділення патогена можуть бути використані при вивченні тих уражень, збудник яких знаходиться під насіннєвою оболонкою (наприклад, при захворюваннях квасолі). Якщо ж патоген поселяється па поверхні насіннєвої оболонки (при захворюваннях гороху або томатів), то проводити поверхневу стерилізацію не можна [19].
Мікроскопічне дослідження ураженої рослини.
Дослідження бактеріальних уражень рослин під микроскопом не дає достатньої інформації. Часто подібне вивчення рослинного матеріалу не дозволяє навіть визначити, чи є дане захворювання бактеріальним за походженням. Причина цього полягає в тому, що при такому дослідженні бактеріальні клітини часто можна сплутати з окремими клітинами рослини, зернами крохмалю і хлорофілу. Бактеріальні клітини, що містяться в рослині, часто не мають навіть тієї форми, яка притаманна їм при культивуванні на штучних поживних середовищах. Вони меншого розміру і неправильної палочковидної форми. Бактерії , що виявляються в препаратах зі старих плям виразки, втрачають свою рухливість. Значно легше вивчати бактерії з молодих уражених ділянок листка. На пізніх стадіях розвитку захворювання мікроскопічну картину дуже спотворює присутність сапрофітних мікроорганізмів, оскільки під мікроскопом їх неможливо відрізнити від фітопатогенних. Тому мікроскопічне дослідження служить лише для отримання загальної інформації про причину захворювання. Таке вивчення набуває значно важливіше значення при фарбуванні тканин, коли бактерії стають різко відмінними за забарвленням від здорових і уражених тканин рослини [16].
Мікроскопічне дослідження уражених тканин з використанням забарвлених зрізів (диференційне фарбування). При вивченні деяких зразків ураженого рослинного матеріалу, таких як стебло або шкірястий листок, зрізи можна приготувати, використовуючи гостру бритву. Тонкі зрізи готують з уражених тканин рослини, укладаючи їх між шматочками писушеної серцевини рослини бузини. Перед використанням край бритви змочують спиртом і отримані зрізи поміщають у воду. Метод диференційного фарбування по Стоутону:
Фарбування карболтіоніном 5 хв (0,1г тіоніна синього на 100мл 5%ного фенолу, що містить дистильовану воду).
Промивання у воді.
3. Перенесення в 95%-ний спирт.
4. Диференційне фарбування Оранжем G на протязі кількох хвилин. (Оранж G розчинений в абсолютному спирті.)
5. Промивання тканин абсолютним спиртом [19].
6. Після перенесення в ксилол зріз накривають покривним склом і поміщують в бальзам.
У готовому забарвленому препараті бактеріальніклітини темно-синього кольору, стінки клітин целюлози – жовті або зелені, лігніфіковані тканини – світло-сині [19].
Отримання чистих культур. Виділення патогeнів проводять на щільних середовищах. Після розливу їх і застигання в чашках Петрі чашки слід деякий час підсушити перед посівом бактерій. Це сприяє виділенню конденсаційної вологи, яка осідає на поверхні середовищ. Ці краплі конденсату не дають можливості отримати ізольовані колонії, так як бактерії плавають в них. Поверхня чашок Петрі з агаром підсушується 30 хв. при 50°С. Металевою петлею бактерії наносять штрихом на поверхню агару в чашках. На стерильному предметному склі готують суспепзію бактерій із заражених рослинних тканин.
Для отримання ізольованих колоній бактеріальну суспензію найкраще наносити штрихом. Спочатку петлю занурюють у суспензії бактерій і на поверхні чашки Петрі зліва направо наносять 5 штрихів. Потім петлю вносять в помум’я пальника і, повернувши чашку на 90°, роблять зправа на ліво ще 5 штрихів. Потім чашку знову повертають праворуч на 90° і роблять штрихи справа наліво. При цьому досягається таке разведеня суспензії, при якому виростають окремі колонії бактерій. Після 48-72год інкубації при 28°С різні типи колоній переносять в пробірки зі скошеним агаром. При вивченні бактеріальних культур, ізольованих з уражених рослинних тканин, звичайно досліджують морфологію клітин і колоній, біохімічні і патологічні методи [19].
Ідентифікація патогенна. Через морфологічні особливості бактерій для їх вивчення не завжди можуть бути використані методи, що застосовуються в мікології. Оскільки визначення грибів і вищих рослин основане на їх морфолог них ознаках, незначні морфологічні відмінності між окремими видами бактерій роблять можливим використанням цих же методів у мікробіoлогії. Деякі фітопатогенні бактерії настільки схожі, що їх не можна розрізнити, використовуючи тільки класичні методи ідентифікації. Для визначення патогенних бактерій використовують наступні критерії:
тест на патотснность для відбору патогенного ізолята;
вивчення морфології бактеріальної клітини і колонії;
визначення фізіологічних і біохімічних властивостей бактерій;
дослідження патогенності для визначення кола господарів [8].
Тест на патогенність для відбору патогенного ізолята. Найкраще спочатку виконати просте і швидке дослідження патогенності бактерій, так як згодом потрібно вивчати біохімію лише тих культур, патогенність яких доведена. Визначити патогенність культури можна протягом 24год, використовуючи метод інфікації Клемента. Він грунтується на реакції надчутливості рослин.
Культури бактерій, отримані після ізоляції, беруться з чашок і суспендується в стерильній водопровідній воді. Число бактеріальних клітин в 1мл такої суспензії, яке визначається за показником оптичної щільності, має становити 107-8. Шприцом суспензію вводять в міжклітинний простір здорового невідділеного листка тютюну. Цей метод дозволяє вводити кілька суспензій в різні ділянки одного і того ж листа тютюну.
Оскільки некрози або інші симптоми ураження на тютюні можуть викликатися тільки фітопатогенними бактеріями (не сапрофітами), то цей метод можна застосувати для швидкого відбору патогенного ізолята. Вивчати слід лише той ізолят, який індукує некрози на індикаторній рослині [19].
Зберігання бактеріальних культур. Зазвичай фітопатогенні бактерії зберігають свою вірулентність в лабораторних умовах тривалий час, але деякі види втрачають життєздатність відносно швидко. Псевдомонади залишаються життєздатними протягом багатьох місяців без пересіву, в той час як ксантомонади гинуть протягом 1-2 тижнів при рості на звичайних і використовуваних бактеріальних середовищах [19].
Методика діагностики опіку плодових Erwinia amylovora. Прискорена діагностика опіку плодових Erwinia amylovora.
Перший день:
А) Попередня діагностика Е. amylovora шляхом постановки реакції преципітації без виділення збудника:

Рис 2.1. Кільця преципітації у 2-й та 4-й пробірках [8]

1. Стерильним скальпелем на межі ураженої і здорової кори роблять зрізи, добре подрібнюють і кладуть 1 грам в пробірку з 10 мл фізрозчину, який містить 5% сахарози;
2. Ставлять в термостат на 1 годину;
3. Частину приготовленої суміші кип'ятять протягом 30 хвилин;
4. Охолоджують і відбирають 1 мл екстракту, добавляють 0,5 мл нор-мальної кролячої сироватки;
5. Витримують в термостаті протягом 30 хв. при температурі 37°С і центрифугують 5 хв. при 3000 обертів.
6. В преципітаційні пробірки вносять: в одну 0,25 мл нормальної, в другу - 0,25 мл імунної до Е. amylovora сироватки крові кролика;
7. Із центрифугату обережно набирають надосадову рідину пастерівсь-кою піпеткою і обережно нашаровують її спочатку на поверхню нормальної, а потім імунної сироватки в преципітаційних пробірках. Облік реакції проводять через 30 хв., 2 години, 4 години (рис 2.1) [8].
Б) Зараження незрілих плодів груші чутливих сортів до Erwinia amylovora екстрактом з кори зразків: з некип'яченого екстракту, підготов-леного раніше для реакції кільцепреципітації, шприцом відбирають 0,5 мл рідини, нею інфікують попередньо вимиті і протерті 5% розчином перекису водню плоди груші і ставлять їх у вологу камеру при температурі 27°С. Облік проводять через 24,48 і 72 години.
При позитивній реакції спостерігається утворення на поверхні плода білої рідини (рис 2.2).

Рис. 2.2. Позитивна реакція Уайта
(виділення молочно-білого ексудату)[8]

В) Виділення бактерій на середовища:
З цього ж екстракту роблять висів бактерій на середовище Кінга та картопляний агар з дріжджовим екстрактом. Облік проводять через 24, 36,48 годин[4].
Другий день:
При наявності на середовищі Кінга нефлюорисцируючих слизистих колоній проводять їх відбір і сіють на селективні середовища Б3 та Кросса і Гурмана.
Облік характеру росту проводять через 24, 48, 60 годин. Колонії Erwinia amylovora на середовищі 03 мають оранжеве забарвлення, колонії інших видів набувають голубого або зеленого кольору.
На середовищі Кроса і Гудмана бактерії Erwinia amylovora утворюють колонії з кратероподібним заглибленням по середині, що добре спостерігається під мікроскопом при збільшенні 15х або 30" [8].
Склад поживних середовищ для ізоляції та ідентифікації
Картопляний агар з дріжджовим екстрактом
Картопля - 200 г
Агар-агар - 20 г
Дріжджовий екстракт – 10 мл
Водопровідна вода – 1000 мл
рН – 7,0 [8].



РОЗДІЛ 3
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження проводились на базі Закарпатського територіального відділу карантину рослин УЗР УААН та кафедрі генетики, фізіології рослин і мікробіології ДВНЗ «УжНУ».
Для визначення основних бактеріальних захворювань плодових рослин, які є небезпечними на даний період в Закарпатській області, були використані дані по виявленню карантинних бактеріальних хвороб в регіоні за 2007-2013 рр. та проаналізовані результати маршрутних обстежень, здійснювані спільно з співробітниками Закарпатського територіального відділу карантину рослин УЗР УААН (таблиця 3.1.).
Обстеженню підлягали насадження зерняткових, кісточкових плодових дерев, а також декоративних та дикорослих культур (глід, кизил, горобина, троянда, спірея, керія та ін). Особливо важливе значення мають обстеження розсадників, де вирощується посадковий і прищепний матеріал, до початку реалізації із них продукції. Проводився огляд вибірково в плодових та декоративних насадженнях регіону. Обстеження проводились у три строки:
1-ранньовесняний (період розпускання бруньок і цвітіння),
2-літній (період інтенсивного росту дерев),
3-осінній (період посиленого сокоруху).
У весняний період проводили суцільне обстеження, де оглядали кожне дерево. Влітку і восени обстеження проводили вибірково, оглядаючи кожне десяте дерево. Звертали увагу на дерева, які пригнічені і висихають, мають пошкоджені квіти, кору та інші ознаки, які характерні для бактеріозів, що визначаються як карантинні.

Таблиця 3.1
Обстеження плодових культур на виявлення карантинних бактеріальних захворювань в Закарпатській області(2007-2013рр.)

п/п
Дата
Місце обстеження
Культура
Результат

Ужгородський р-н

1
26.07.2007
с. Сторожниця
Яблуня
Еrwinia аmуlovora

2
26.07.2007
с. Сторожниця
Груша
Е. аmуlovora

3
26.07.2007
с. Малі Геївці
Груша
P. agolovera

4
26.07.2008
с. Червоне
Груша
Е. аmуlovora

5
18.08.2008
с. Червоне
Груша
Е. аmуlovora

6
18.08.2008
с. Червоне
Айва


7
08.04.2009
с. Селенці
Груша
Е. аmуlovora

8
23.05.2009
с. Нижнє Солотвино
Абрикос
Е. аmуlovora

9
05.06.2009
с. Селенці
Груша
Е. аmуlovora

10
24.07.2009
м. Ужгород
Абрикос


11
03.06.2010
с. Червоне
Айва


12
20.06.2010
с. Оноківці
Слива
Xanthomonas arboricola

13
10.07.2010
с. Сторожниця
Яблуня
Е. аmуlovora

14
05.04.2011
м. Ужгород
Груша


15
30.08.2011
с. Оноківці
Яблуня


16
27.09.2011
с. Мала Добронь
Яблуня


Мукачівський р-н

17
01.07.2009
с. Страбичово
Груша
Е. аmуlovora

18
01.07.2009
с. Ракошино
Груша
Е. аmуlovora

19
03.06.2010
с. Страбичово (на 2-х ділян-х)
Груша
Е. аmуlovora

20
24.06.2010
с. Великі Лучки
Яблуня
Е. аmуlovora

21
27.09.2011
с. Страбичово
Груша


Берегівський р-н

22
31.07.2007
с. Гать
Яблуня


23
26.06.2008
с. Бовтрадь
Айва


24
01.07.2009
с. Батєво
Яблуня


25
20.07.2010
с. Гать
Яблуня


Виноградівський р-н

26
05.06.2009
с. Петрово
Груша


Воловецький р-н

27
28.06.2010
с. Нижні Ворота
Абрикос


28
05.06.2012
с.Ракошино, Мукачівський р-н
Груша
X. arboricola

29
25.06.2013
с.Гать, Берегівський р-н
Персик
X. arboricola

30
14.05.2013
с. Селенці, Ужгородський р-н
Айва
X. arboricola

31
14.05.2013
с. Селенці, Ужгородський р-н
Яблуня
Е. аmуlovora

Відповідно до статті 25 Закону України « Про карантин рослин» затверджено «Перелік регульованості шкідливих організмів (бактеріальні хвороби)». Серед них названі такі бактеріози:
1. Erwinia amylovora (Burrill) Winslowetal. – Бактеріальній опік плодових.
2. Xanthomonas arboricola pv. pruni (Smith) Vauterinetal. – Бактеріальна плямістісь листя кісточковіх
При виявленні підозрілих на зараженість дерев відбирали зразки для ідентифікації збудника. Для відбору зразка з ураженими квітками секатором зрізали верхню частину пагону довжиною біля 10 см. При ураженні листків чи одночасно квітів і листків на одній гілці зрізали пагін довжиною 15-20 см. При наявності виразок на корі гілок зрізали відрізки довжиною до 20 см. При ураженні скелетних гілок чи стовбура робили спили гілок або глибокий зріз кори. Відрізки гілок, пагонів і кори зрізали із захопленням здорових частин рослини таким чином, щоб добре була помітна межа між здоровою та ураженою тканиною. В залежності від уражених частин і ступеня ураження з одного дерева, по можливості відбирали 3-5 зразків із різних частин рослини. При переході від одного дерева до іншого інструменти дезинфікували 1%-ним формаліном або 10% розчином гіпохлорита натрію (хлорокс) протягом 2-х секунд. До кожного зразку додавалась етикетка, на якій пишеться назва дерева, сорту, вік, місце і час відбору з описанням ознак хвороби. Відібрані зразки пакувались окремо в папір. Не можна запаковувати в пергамент, кальку, целофан та поліетилен, оскільки це призводить до розвитку сапрофітних грибів, що утруднює виділення бактеріальної культури. Зразки були доставлені в карантинні лабораторії протягом двох днів, де і проводився аналіз зразків та ідентифікація збудника, і, по необхідності, проводилась повна бактеріологічна експертиза чи використовувалась прискорена діагностика.
Обстеження проводилися у квітні-травні – перед початком та у фазу цвітіння, в червні – в період швидкого росту пагонів та в середині липня – під час плодоношення.
Період цвітіння. Проводилося візуальне обстеження насаджень на початку цвітіння. Симптоми ураження бактеріальним опіком мали наступний характер: квітки в суцвіттях темніли, набуваючи спочатку коричневого, а потім чорного забарвлення, згодом всихало все суцвіття; уражені квітки не опадали, створюючи враження обпалених вогнем дерев. Найчастіше спочатку уражувались одна – дві квітки, від яких згодом інфекція передавалась на все суцвіття, що, ймовірно, обумовлювалось нерівномірністю розпускання квіток.
Період росту пагонів. У період інтенсивного росту молодих пагонів хвороба спостерігалися за такими симптомами: слабкі симптоми на листках, які темніли, та зелених плодах, що зморщувались і всихали; налиті рідиною молоді пагони, на корі яких спостерігався маслянистий слід від висохлого ексудату; зморщені та почорнілі, але не опалі уражені молоді плоди.
Період плодоношення. Під час фітопатологічного обстеження плодових насаджень в період плодоношення в липні на них були такі характерні симптоми бактеріального опіку – гачкоподібно зігнуті кінчики пагонів. Ззовні та на зрізах гілок уражена тканина чітко відмежовувалась від здорової.
Подальшої інтенсифікації розвитку хвороби відмічено не було.
Систематизували дані обстежень плодових культур за роками. У таблиці 3.2 наведене співвідношення кількості обстежень ділянок та виявлень на них карантинних бактеріальних захворювань.
Найбільш небезпечним на сьогоднішній час є опік плодових, який був вперше виявлений у Закарпатті в 2003р. Також зустрічається захворювання, збудником якого є Xanthomonas arboricola.
Бактеріальна плямистість. Збудник: Xanthomonas arboricola.(Рис 3.1.)
X. arboricola pv. pruni є аеробними, рухливими, грамнегативними, 0,2-0,8х0,8-1,7 мкм, з одним полярним джгутиком. Колонії вологі, блискучі, опуклі, слизисті і виробляють жовтий нерозчинний у воді пігмент.
Таблиця 3.2
Результати обстежень плодових культур на виявлення карантинних об’єктів в Берегівському районі
Рік
Загальна кількість обстежень
Кількість виявлених випадків захворювання
Збудник
Захворювання

2007
11
3
Еrwinia аmуlovora
Бактеріальний опік

2008
6
2
Е. аmуlovora
Бактеріальний опік

2009
27
7
Е. аmуlovora
Бактеріальний опік

2010
28
4
Е. аmуlovora
Бактеріальний опік



1
Xanthomonas arboricola
Бактеріальна гниль

2011
143
0



2012
56
1
Xanthomonas arboricola
Бактеріальна гниль

2013
48
2
Xanthomonas arboricola
Бактеріальна гниль



1
Е. аmуlovora
Бактеріальний опік


Бактеріальна плямистість є важливою хворобою персика, нектарини, абрикоса, сливи, волоського горіха та інших. Симптоми цього захворювання включають плями на листках та фруктах, і виразки. На фруктах до симптомів включають виразки, тріщини, зміну тканини, яка може зробити плоди більш сприйнятливі до бурої гнилі та інших грибкових інфекцій. Важкі інфекції, плямистості листя може призвести до ранньої дефоліації. Важкі дефоліації можуть призвести до зниження розміру плодів і сонячних опіків та розтріскування плодів. Ранні дефоліації дерев знижують зимостійкість рослин.

Рис.3.1. Колонії Xanthomonas arboricola на КА
(Фото автора)

Xanthomonas може заразити велику різноманітність видів, включаючи перець, рис, цитрусові, бавовну, помідори, сою. Деякі види Xanthomonas викликати локалізовані плямистості листя або смуги на листі, в той час як інші системно поширюватися і викликати чорна гниль або хвороби листя занепаду.
Симптоми захворювання, що викликається Xanthomonas arboricola включають плями на фруктах, плями на листі, і виразки. Симптоми на фруктах включають виразка, тріщин, гумування тканини, яка може зробити плоди більш сприйнятливі до бурої гнилі, Rhizopus та інших грибкових інфекцій. Важкі випадки плямистості листя може призвести до ранньої дефоліації. Сильна дефоліація може призвести до зниження розміру, сонячних опіків і розтріскування плодів. Ранні дефоліації дерев знижуються і силу зимостійкості.(Рис. 3.2.-3.6)

Рис. 3.2. Листки персика, уражені бактеріальною плямистістю
(Фото автора)


Рис.3.3.Фрагмент листка персика, ураженого бактеріальною плямистістю
(Фото автора)

Рис.3.4. Гілка персика уражена бактеріальною плямистістю
(Фото автора)


Рис.3.5.Плід персика, ураженого бактеріальною плямистістю
(Фото автора)


Рис.3.6. Плід сливи, ураженої бактеріальною плямистістю
(Фото автора)
На листках персика інфекція спочатку проявляється на нижній поверхні як маленькі, блідо-зелені до жовтого, круглої або нерівної форми плями з легким потемнінням в центрі. Ці плями незабаром стають дуже помітні на верхній поверхні, вони збільшуються і темнішають (в темно-фіолетові, коричневі або чорні) (рис. 3.2.,3.3.).Безпосередньо навколишні тканини можуть стати жовтими. Хворі ділянки випадають зазвичай після потемніння, але вони можуть випадати до зміни кольору. Часто темне кільце ураженої тканини набуває форму «свердловини».
Бактеріальний опік плодових. Збудник: Erwinia amylovora. Карантинна хвороба розвивається більш ніж на 170-ти культурних та дикорослих видах рослин, більшість з яких належать до родини розових. Плодові культури по чутливості до опіку можна розмістити в такому порядку: груша, яблуня, айва, слива, абрикос, вишня, персик і т.д. Декоративні та дикорослі: кизил, глід, фотинія, піроканта, горобина, китайська айва, японська мушмула, спірея, керія, троянда. Існує виражена сортова різниця в чутливості до захворювання. Уражує майже всі плодові культури, а також глід, горобину й інші. В Україну хвороба потрапила з посадковим матеріалом, і на цей час зареєстрована в Закарпатській і Чернівецькій областях. Уражуються квіти, листки, пагони, гілки, стовбур, корінь, плоди.
Розвиток хвороби починається з верхньої частини дерева. Навесні, коли температура сягає +18°С, раптово починають в’янути й буріти суцвіття, листя та молоді пагони. Суцвіття й листя згодом чорніють, але не опадають. Характерна ознака хвороби верхня частина ушкодженої гілки вигинається у вигляді гачка. Недозрілі плоди теж в’януть, зморщуються, чорніють і так само залишаються на дереві. Уражені дерева виглядають як пошкоджені вогнем, обпалені. На корі уражених гілок і на плодах з часом з’являються краплини ексудату. Спершу вони безбарвні, потім стають жовтими або темно-коричневими і застигають у вигляді кульок. Виділення ексудату головна ознака, яка відрізняє ервінію від інших бактеріальних хвороб.

Рис.3.7.Гілка, уражена Erwinia amylovora (характерний вигин у виді гачка)
(Фото автора)


Рис.3.8. Квітки, уражені бактеріальним опіком
(Фото автора)




Рис. 3.9. Виділення ексудату на плодах яблуні (в природніх та лабораторних умовах)
(Фото автора)


Рис.3.10. Уражена бактеріальним опіком частина стовбуру
(Фото автора)
Улітку хвороба затухає, але наступної весни з початком сокоруху відновлюється з іще більшою інтенсивністю. Хворобу поширюють краплини дощу й комахи, передусім попелиці, короїди, бджоли, а також птахи. Окрім того, може передаватися з садовим реманентом і посадковим матеріалом. Шкідливість бактеріального опіку плодових дуже велика, може призвести до масової загибелі насаджень. 
Властивості збудника бактеріального опіку плодових. . Клітини Erwinia amylovora являють собою палички із заокругленими кінцями та перитрихальним розташуванням джгутиків, грамнегативні, оксидазонегативні, спор та капсул не утворюють, факультативні анаероби, оптимальна температура росту становить 27 – 300С.
Виділені з уражених зразків бактерії через 48 год. утворювали на картопляному агарі круглі, з рівними краями, блискучі колонії сірувато-білого кольору, напівпрозорі, маслянистої консистенції, зморшкуваті або з рівною гладкою поверхнею. У разі додавання до інкубаційного середовища дріжджового автолізату ріст колоній завершувався через 24 год. Для остаточної ідентифікації ізолятів вивчали їх здатність засвоювати різні органічні сполуки та синтезувати ферменти. За всіма ознаками досліджувані ізоляти були ідентичні колекційному штаму E. amylovora 2024 і штамам, описаним у літературі [8].



ВИСНОВКИ


1. Найбільшою загрозою насадженням плодових рослин серед збудників бактеріальних захворювань є фітопатогени представлені грампозитивними та грамнегативними бактеріями і мікоплазмами, серед яких найчастіше зустрічаються бактерії родів Pseudomonas, Xanthomonas, Agrobacterium, Erwiniа, Clavibacter, Cоrynebacterium, Streptomyces.
2. Бактеріальний опік плодових, збудником якого є Erwinia amylovora, що здатна спричиняти епіфітотії.
3. На основі вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних властивостей та антигенного складу ізоляти, виділені з уражених тканин плодових культур в Закарпатській області, віднесені до E. аmylovora та X.arboricola.
4. Встановлено, що у разі високої інтенсивності захворювання збудник бактеріального опіку плодових проникає на значну відстань від видимої межі ураження, тобто, реальна межа поширення інфекційного процесу не збігається з візуальним її проявом.
5. Найуразливішими до патогену є зелені однорічні пагони, натомість у багаторічних гілках захворювання поширюється значно повільніше, при цьому уражена тканина від здорової чітко не відмежовується. Такі гілки доцільно видаляти повністю.
6. Відзначено селективний вплив однорічних пагонів та багаторічних гілок на агресивність популяцій E. аmylovora. В період інтенсивного росту дерев в уражених тканинах молодих пагонів E. аmylovora міститься у високоагресивній формі. У скелетних гілках та стовбурі інфекційний процес відбувається значно повільніше, ніж в молодих гілках, оскільки тут превалюють неагресивні форми патогену.
7. В умовах інтенсифікації сільськогосподарського виробництва проблема боротьби з фітопатогенними мікроорганізмами на Закарпатті не втрачає своєї актуальності.



RESUME
Bacterial diseases of fruit crops in Transcarpathian region

Much of the fruits yield is lost due to bacterial diseases of plants. The disease agents belong to different taxonomic groups. Рlant pathogenic microbes control is particularly acute in intensive agriculture. Bacterial diseases are reflected by weakening of trees, loss of marketable fruit quality and yield production. Complete death of plants could be observed under favorable conditions for certain diseases.
By study of diseases of fruit plants in Transcarpathian region, special attention was concentrated on the identification of walnut bacteriosis (pathogen Xanthomonas juglandis), crown gall (Agrobacterium tumefaciens), bacterial cancer (Pseudomonas syringae pv. morsprunorum), bacterial blight (Erwinia amylovora) and others.
We conducted the study of spread and colonization intensity on plant organs of various fruit plant pathogens in small gardens and farmland area. The following diseases were revealed in the Transcarpathian region: bacterial cancer, bacterial blight, and others. Pathogenicity of fire blight agent (Erwinia amylovora) we studied at the Transcarpathian regional Plant Quarantine Department of the Institute of Plant Protection of the Ukrainian Academy of Agrarian Science. The severity of the diseases to individual plants ranged from minor to medium damage.
Thus, fruit plants in our region are under the threat of bacterial diseases, such as Erwinia amylovora, Pseudomonas agolovera, Xanthomonas arboricola.




Резюме
Бактеріальні хвороби плодових культур Закарпатської області

Значна частина врожаю втрачається через бактеріальнi хвороби рослин. Збудниками бактеріозів рослин мікроорганізми-представники різних систематичних груп. В умовах інтенсифікації сільськогосподарського виробництва проблема боротьби з фітопатогенними мікроорганізмами стоїть особливо гостро.
Шкідливість бактеріальних хвороб виражається в ослабленні дерев, втраті товарної якості плодів та урожайності, а при сприятливих умовах розвитку деяких хвороб – в повній загибелі рослин.
При дослідженні захворювань плодових рослин Закарпатської області особливу увагу концентрували на виявленні та вивченні таких захворювань як: бактеріоз грецького горіху (збудник Xanthomonas juglandis), бактеріальний рак (Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonassyringae pv. morsprunorum), бактеріальний опік (Erwinia amylovora) та інші.
Вивчали особливості поширення та інтенсивності заселення різних органів плодових рослин патогенними мікроорганізмами. Проводили обстеження з відбором рослин на присадибних ділянках та виробничих угіддях. При діагностиці поширення бактеріальних захворювань плодових рослин у Закарпатській області були виявлені такі захворювання: бактеріальний рак, бактеріальний опік плодових та інші. Суворість симптомів коливалась від незначних до уражень середнього рівня.
Загрозою для насаджень плодових рослин є збудники Erwinia amylovora, Pseudomonas agolovera, Xanthomonas arboricola.
Патогенність збудника бактеріального опіку – Erwinia amylovora- вивчали на базі Закарпатського територіального відділу карантину рослин IЗР УААН.




СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ


Бактериальные болезни растений / ред. Израильский В.П. / М.: Колос, 1979.
Билай В.И.,Э Гвоздяк Р.И., Скрипаль И.Г. и др.: Пол ред. Билай В.И. Микроорганизмы – возбудители болезней растений – Киев :Наук.думка, 1988
Бичко А.С. Мікробіологія з основами вірусології: Конспект лекцій для студ. педвузів зі спец. 7.070.401 «Біологія» / Глухівський держ. педагогічний ін-т ім. С.М.Сергєєва-Ценського. – Глухів 1999. – 26 с.
Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М., 1984.– 87 с.
Бургвиц Г.К. Бактериальные болезни растений – Ленинград: «Академия наук», 1936
Бургвиц Г.К. Фитопатогенные бактерии – Ленинград: «Академия наук», 1935
Векірчик К.М. Мікробіологія з основами вірусології: Підручник. – К.: Либідь, 2001. – 312 с.
Виявлення, діагностика та локалізація бактеріального опіку плодових: тимчасові методичні вказівки : К, 2000
Воробьов А.А. Микробиология – М., «Медицина», 2003
Воронкевич И.В. Выживаемость фитопатогенных бактерий в природе, 1974.
Генкель П.А. Физиология растений. М., 1975.
Горленко М.В. Бактериальные болезни растений. М.: Колос, 1981.
Григорцевич Л.Н.,Макаревич А.И. Защита плодовых деревьев от болезней– Мн.: «Современное слово», 1998
Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов. 4-е изд., стер. М.: Издательский центр «Академия», 2003. 464 с.
Дацищин О.В., О.В. Гвоздєв, Ф.Ю. Ялпачик,Ю.П. Рогач; За ред. О.В. Дацищина. Механізація переробки і зберігання продовольчої продукції: Навч. посібник – К.: Мета,2003.
Егоров М.Ю. Практикум по микробиологии. – М.: Изд. МГУ, 1988. – 220 с.
Желдакова Р. А., Мямин В. Е. Фитопатогенные микроорганизмы: Учеб.- метод. комплекс для студентов биол. фак. спец. «Биология» – Мн. : БГУ, 2006. – 116 с.
Защита растений от болезней/В. А. Шкаликов, О. О. Белошапкина, Д. Д. Букреев и др.; Под ред. В. А. Шкаликова. 3-е изд., испр. и доп . М.: КолосС, 2010. 404 с.,
Кирай З., КлементЗ. Методы фитопатологии – М.,Колос – 1974
Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбокова М.С Практична мікробіологія: Посібник.-Тернопіль: Укрмедкнига, 2004.-440с
Корчагин В.Н. Вредители и болезни плододых и ягодных культур – М. Колос, 1971
Кудрявцева З.Н. Микробиология с основами фитопатологии – Минск, 1968.
Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М., 1972. – 390с.
Лысак В.В. Микробиология : учеб.пособие: БГУ, 2007
Мигаль А.В., Чепур С.С. Методичні вказівки до лабораторниз робіт з курсу „Фітопатологія” для студентів вищих навчальних закладів III-IV рівнів акредитації напряму „Лісове та садово-паркове господарство. – Ужгород: Вид-во УжНУ „Говерла”, 2011.
Микроорганизмы - возбудители болезней растений. Киев, Наукова думка, 1988.
Руководство для изучения бактериальных болезней растений. М.: Колос, 19669.
Семенкова И.Г., Соколова Э.С. Фитопатология – М.,2003 – 480с.
Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. М.О. Биргера. Изд. «Медицина». Москва 1967.
Станчева Йорданка. Атлас болезней сельскохозяйственных культур. Болезни плодовых, ягодных, орехоплодных культур и винограда – Болгария: 2005
Тарр С.А. Основы патологии растений, – М.:Мир, 1975.
Хохряков М.К. Определитель болезней растений. – М., 2003
Черемисинов Н.А. Общая патология растерий. Учебное пособие для университетов и сельхозвузов – М.: «Высшая школа»,1973
Чикин Ю.А. Общая фитопатология (часть 1): учебное пособие. – Томский госуниверситет – Томск, 2001 – 170 с.
Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. – М.: Мир,1987. – 567с.
Janse J. D. Phytobacteriology: principles and practice. CABI Publishing, 2005
Molecular Plant–Microbe Interactions. Edited by Kamal Bouarab,Normand Brisson, Fouad Daayf, CABI Publishing, 2009.
Plant Innate Immunity. Editor L. C. VAN LOON, Elsevier, 2009.
Richard N. Strange. Introduction to Plant Pathology, John Wiley & Sons Ltd, 2003.
The Procaryotes, Vol. 1,2. 1981.
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]. [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]













Чалбаш Наталія Володимирівна

«БАКТЕРІАЛЬНІ ХВОРОБИ ПЛОДОВИХ КУЛЬТУР ЗАКАРПАТСЬКОЇ ОБЛАСТІ»

Дипломна робота на здобуття освітньо-кваліфікаційного рівня «Магістр»
Науковий керівник –к.б.н., доц. В.І. Петросова.
Рецензент к.б.н., доц. каф. плодоовочівництва і
виноградарства Маргітай Л.Г.

Робота представлена на кафедру «______» ___ ________2014 р.
Об’єм роботи: «» друкованих сторінок, у тексті ___ табл., ____ рис.
Захист відбувся «_____» ____________ 2014 р.
Протокол ДЕК № ____ від «____»____________ 2014 р.
Оцінка: _____________________










13PAGE \* MERGEFORMAT145615




Рисунок 5 Заголовок 1 Заголовок 215

Приложенные файлы

  • doc 8327668
    Размер файла: 588 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий