Рубцов Гибридизация in situ

1.4. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ в анализе хромосомных аномалий
проф. Н.Б. Рубцов, ИЦиГ СО РАН, Новосибирск
Флуоресцентная in situ гибридизация (Fluorescence In Situ Hybridization – FISH) в настоящее время широко используется при проведении цитогенетического анализа в диагностике различных наследственных патологий и реорганизации хромосом при онкологических заболеваниях. Ее широкое использование началось в 90-х годах. Оно было обусловлено значительным прогрессом в развитии методов молекулярной генетики, химии флуорохромов, микроскопической техники, а также методов регистрации и обработки микроскопических изображений. Использование FISH особенно при ее использовании в комбинации с другими современными технологиями позволило с одной стороны значительно повысить надежность диагностических исследований, а с другой – открыть принципиально новые возможности в идентификации аномальных хромосом и в выявлении хромосомных аномалий.
Внедрение FISH в диагностическую практику принципиально измелило положение дел в анализе аномальных хромосом. Достаточно сравнить возможности традиционных методов анализа хромосомных перестроек и результатов использования для решения этих задач многоцветной FISH. До развития методов молекулярной цитогенетики основным способом выявления и идентификации аномальных хромосом являлся анализ их GTG-дифференциального окрашивания. Сравнение результатов стандартного хромосомного анализа и 24-х цветной FISH при диагностике гематологических заболеваний и оказалось шокирующим [46]. В ряде таких сравнительных исследований было показано, что методы дифференциального окрашивания хромосом в случаях гематологических заболеваний позволяли выявлять и правильно идентифицировать лишь около трети аномальных хромосом. Остальные две трети делились пополам на две примерно равные группы: группу неправильно описанных хромосомных аномалий, группу аномальных хромосом, которые не были выявлены традиционными методами диагностики. Еще более печальный результат оказался при оценке эффективности традиционных методов хромосомного анализа для диагностики солидных опухолей. GTG-дифференциальное окрашивание хромосом позволило правильно описать лишь 15% перестроенных хромосом, выявленных с помощью 24-х цветной FISH. Остальные аномальные хромосомы, описанные 24-х цветной FISH, как и в случае гематологических заболеваний разделились две примерно равные группы (Эвелин Шроек, персональное сообщение). Эти грустные результаты вполне можно было ожидать, так препараты хромосом раковых клеток печально известны своим низким качеством. Причем, проблема заключается не только, или не столько в малом числе метафаз, сколько в плохой морфологии метафазных хромосом.
При анализе наследственных и врожденных аномалий возможности рутинного цитогенетического анализа значительно расширены, так для анализа могут быть использованы прометафазные и профазные хромосомы. Тем не менее, и в этом случае использование FISH позволяет либо решать оставшиеся после использования традиционных методов проблемы, либо исправлять ошибки, допущенные ранее при описании аномальных хромосом. Наглядной иллюстрацией этого является работа Эвелин Шроек с соавторами [41], в которой было проведено сравнение результатов восьми цитогенетических лабораторий, после хромосомного бэндинга и 24-х цветной FISH. Более чем в половине случаев диагноз был либо уточнен, либо исправлен. Опыт наших работ также показал, что уточнение диагноза с помощью FISH нередко приводит к его существенной коррекции. Например, при проверке случая, исходно описанного как трисомия хромосомы 22 [50], оказалось, что лишняя хромосома состоит, в основном, из части короткого плеча хромосомы 11, а от хромосомы 22 в ее состав вошел только прицентромерный район и короткое плечо. Случай, в котором предполагалась делеция небольшого района длинного плеча хромосомы 5, оказался сбалансированной траслокацией хромосом 5 и 20 (рис. 1).
Однако, использование FISH для проверки и коррекции результатов рутинного цитогенетического анализа является лишь небольшой частью новых возможностей. Так визуализация материала хромосом и их районов при проведении FISH не зависит от стадии клеточного цикла, то появилась возможность проведения цитогенетического анализа при отсутствии у цитогенетика препаратов митотических хромосом пациента. Более того, для выявления некоторых хромосомных перестроек оказалось достаточно иметь лишь небольшой образец анализируемого материала. Сравнительная геномная гибридизация, о которой речь пойдет в следующей главе позволяет выявлять полные и частичные моносомии, трисомии и другие подобные нарушения, даже при наличии в распоряжении исследователя небольшого блока архивного материала, взятого у пациента много лет назад. Развитие методов диагностики, базирующихся на FISH, привело к возникновению новой области цитогенетики, которую часто называют интерфазной цитогенетикой.
В настоящей главе будут кратко рассмотрены основные принципы проведения FISH и ее применения в хромосомной диагностике.

Общие принципы проведения гибридизации нуклеиновых кислот
in situ.
Если опустить мелкие, но очень важные для получения положительного результата пункты протокола гибридизации in situ, то она заключается в ведении в ДНК метки, денатурации меченой ДНК и ДНК цитологического препарата с последующей их совместной ренатурацией, обеспечивающей формирование дуплексов меченой ДНК и ДНК препарата. Меченая ДНК, несвязанная с ДНК препарата, отмывается. После чего проводится детекция (визуализация на цитологическом препарате) меченых фрагментов ДНК. Конечно, для проведения успешной FISH необходимо обеспечить доступ меченой ДНК к ДНК цитологического препарата и при этом обеспечить сохранность его морфологии. Последнее особенно важно, если FISH проводится с метафазными хромосомами.
В проведении FISH можно выделить несколько этапов: подготовка цитологического препарата; выбор и подготовка ДНК-пробы, проведение гибридизации ДНК in situ; отмывка препарата от негибридизовавшейся меченой ДНК; микроскопия; регистрация изображения; анализ микроскопического изображения. Протоколы проведения FISH представлены в многочисленных оригинальных статьях и методических руководствах [2; 28], поэтому мы не будем рассматривать их конкретные варианты. Детальное обсуждение механизмов прохождения гибридизации нуклеиновых кислот in situ и значимых факторов требует отдельного и большого обсуждения и более уместно методическом руководстве. Поэтому в настоящей главе мы рассмотрим только основные принципы проведения гибридизации нуклеиновых кислот in situ.
Цитологические препараты для проведения FISH.
Если не рассматривать такие варианты, как 3D-FISH, которая проводится для анализа локализации нуклеиновых кислот в образце, сохранившем свою трехмерную организацию, и FISH с физическими срезами, то можно сказать, что она всегда проводится с материалом распластанном на стекле. Этот материал должен отвечать двум требованиям: с одной стороны, обеспечивать доступность меченой ДНК к ДНК препарата, с другой – он должен сохранять свою исходную морфологию, несмотря на жесткие условия денатурации ДНК и последующей ренатурации. Обычно, для того, чтобы препарат соответствовал этим требованиям, фиксированный (метанол/ледяная уксусная кислота в соотношении 3/1) и распластанный на стекле материал либо выдерживают несколько дней при комнатной температуре (возможно ускорение процесса термообработкой), а затем непосредственно перед проведением FISH обрабатывают раствором пепсина и проводят дополнительную фиксацию параформальдегидом. Это наиболее стандартный вариант при проведении FISH с митотическими хромосомами и интерфазными ядрами. Несколько иначе готовятся препараты для FISH с распластанными нитями хроматина и чистой ДНК [18].
ДНК-пробы.
К ДНК-пробам относятся любые препараты меченой ДНК, которые могут быть использованы для проведения гибридизации in situ: клонированные фрагменты ДНК, ДНК отдельных хромосом и хромосомных районов, а также геномная ДНК интересующего исследователя образца. Минимальные размеры последовательности ДНК, которую можно использовать для FISH зависят от чувствительности системы детекции и числа копий этой последовательности, если в образце она такая последовательность повторена многократно, и ее копии локализованы близко друг к другу. Рассматривая возможности современной FISH, следует отметить, что существует возможность локализации с ее помощью уникальных последовательностей размером менее сотни пар нуклеотидов. Однако, это требует использования очень сложной системы детекции, включающей создание в районе ее локализации специальной генно-инженерной структуры, обеспечивающей наработку меченой ДНК с помощью phi29 ДНК-полимеразы. Из-за сложности и дороговизны этого метода он, практически не используется в современной диагностике. Стандартные методы FISH позволяют проводить локализации уникальных последовательностей ДНК размером не менее 1000 пар оснований. Но в диагностике обычно используются более протяженные фрагменты ДНК, состоящие из десятков и тысяч пар оснований. Это обеспечивает выявление интенсивного и надежного сигнала.
Эти ДНК пробы представляют собой не единую молекулу, а множество фрагментов ДНК размером менее тысячи пар оснований, которые относительно равномерно покрывают последовательность ДНК пробы, даже если она представляет целую хромосому или ее протяженный район. Проведение FISH хромосомоспецифичных ДНК-проб с метафазными хромосомами в отличие от ДНК-проб, приготовленных на базе клонированных последовательностей, как бы окрашивает всю соответствующую хромосому (рис. 1). В связи с этим, такие пробы в англоязычной литературе получили название Whole Chromosome Paints – WCPs. Проведение FISH таких ДНК-проб имеет ряд особенностей. Хромосомы человека содержат множество повторенных последовательностей ДНК, в том числе и последовательностей, распределенных по всей длине хромосом. Так как хромосомоспецифичные ДНК-пробы индивидуальной хромосомы представляет значительную часть ее ДНК, в ее состав входят меченые повторенные последовательности, присутствующие и в других хромосомах. Причем число копий этих повторов в составе хромосомоспецифичной ДНК-пробы многократно больше, чем число копий любой уникальной последовательности. В связи с этим постановка FISH в обычном варианте приведет к интенсивному сигналу во всех хромосомных районах. Для выявления специфичного сигнала необходимо вывести из гибридизации с ДНК хромосом фрагменты, содержащие повторенные последовательности. Это возможно сделать, либо предварительно удалив из хромосомоспецифичных ДНК-проб повторенные последовательности, либо предотвратив их гибридизацию с ДНК хромосом. В практической диагностике используется второй подход. Для этого меченая ДНК перед гибридизацией отжигается с 50-100 кратным избытком немеченой Cot1 ДНК человека (фракция высокоповторенной ДНК человека). В результате этого отжига основная масса фрагментов меченой повторенной ДНК переводится в двухнитчатую форму и, таким образом, предотвращается ее гибридизация с ДНК хромосом, интерфазных ядер, распластанного хроматина находящейся на цитологическом препарате. Cot1 ДНК человека коммерчески доступна как и хромосомоспецифичные ДНК-пробы. FISH c супрессией гибридизации диспергированных повторов получил широкое распространение при диагностике хромосомных патологий и свое собственное название: Chromosomal In Situ Suppression hybridization (CISS-гибридизация).
Использование стандартных наборов реактивов и ДНК-проб обычно гарантирует получение надежных и воспроизводимых результатов, тем не менее, для их адекватной оценки необходимо учитывать ряд факторов. Хромосомоспецифичные ДНК-пробы могут быть получены разными методами, что отражается на их составе и на конечных результатах FISH. В настоящее время большинство коммерчески доступных хромосомоспецифичных ДНК-проб производят путем амплификации ДНК индивидуальных хромосом, сортированных помощью проточной цитометрии, а амплификация ДНК выполняется в полимеразной цепной реакции, обеспечивающей ее секвенснезависимую амплификацию [44; 48].
Проточная цитофлуорометрия в комбинации с сортером позволяет выделять индивидуальные хромосомы из смеси метафазных хромосом. Принцип работы этого комплекса приборов заключается в идентификации окрашенной флуорохромами хромосомы по уровню ее свечения, вызванному облучением лазерами, выделении ее в микрокапле и направлении этой микрокапли по определенной траектории в соответствующую ловушку. Пример распределения индивидуальных хромосом человека по интенсивности свечения при окраске Hoechst 33258 и хромомицином А3 приведен на рисунке 2. Удивительно, но этот подход позволил собрать не только индивидуальные хромосомы человека, но даже разделить все хромосомы собаки [51]. Следует заметить, что задача идентификации всех хромосом собаки методами традиционной цитогенетики остается нерешенной и настоящее время. Предложенные варианты номенклатуры дифференциально окрашенных хромосом этого вида противоречивы и не эффективны.
Метод изоляции индивидуальных хромосом с помощью проточной цитофлуорометрии оказался наиболее эффективным и высокопроизводительным. До начала 90-х годов полученный таким образом материал использовали для получения фаговых ДНК-библиотек сортированных хромосом. Эта технология была достаточно дорогой и трудоемкой. Она также требовала большого количества исходного материала. Поэтому разработка эффективных методов ПЦР, позволяющих амплифицировать ДНК вне зависимости от первичной последовательности нуклкотидов имела огромное значение.
Идея технического решения использования для создания ДНК-проб индивидуальных хромосом полимеразной цепной реакции была очевидна. Выделенная ДНК индивидуальных хромосом должна быть переведена в форму небольших фрагментов от 200 до нескольких тысяч пар оснований (желательно около 1000 пар оснований), которые должены быть фланкированы универсальным праймером. Одним из наиболее эффективных для решения этой проблемы методов нужно признать предложенную в 1989 году LA-PCR (Linker-Adapted PCR) систему секвенснезависимой амплификации ДНК [29]. Следует иметь в виду, что термин LA PCR используется в настоящее время также для сокращения «Long and accurate PCR» (Takara Bio Inc, http://www.takara-bio.com/lapcr/title1.htm). ДНК обрабатывали мелкощепящей рестриктазой по RsaI-сайтам, расстояние между которыми в геноме человека в среднем составляет 493 пары оснований, к полученным фрагментам ДНК присоединяли синтетические олигонуклеотидные линкеры, содержащие последовательность гомологичную прямому и обратному праймерам М13/pUC. Полученный материал амплифицировали в стандартной ПЦР. Равномерное распределение RsaI сайтов в гене человека, как и других исследованных видов млекопитающих, позволило решить проблему полногеномной амплификации ДНК любых видов. Метод позволял получать ДНК-пробы даже из одной копии хромосомы, но требовал проводить выделение и первичную обработку ДНК в нанолитровых объемах, что предполагало использование микроманипуляционных процедур и делало метод крайне трудоемким [30; 42].
Идея секвенс-независимой амплификации ДНК была реализована в многочисленных исследованиях, в результате которых был предложен целый набор методов [48; 27]. Наиболее простой и достаточно эффективной оказалась амплификации ДНК с частично вырожденным праймером (Degenerate Oligonucleotide-primed Polymerase Chain Reaction - DOP-PCR) [44; 51]. И сегодня, спустя почти 20 лет DOP-PCR наиболее широко используется для создания районо- и хромосомоспецифичных ДНК-проб [51].
Особенностью DOP-PCR является ее проведение в два этапа. Низкая температура отжига (300C) на первых циклах обеспечивает множественный отжиг праймера и генерацию фланкированных им фрагментов ДНК. Дальнейшее экспоненциальное увеличение числа копий этих фрагментов достигается в последующих высокотемпературных циклах при температуре отжига (560С) (рис. 3). В этих условиях проведения DOP-PCR в амплификацию вовлекалась значительная часть исходной ДНК, достаточная для создания на основании полученного продукта качественных хромосомоспецифичных ДНК-проб.
Полученная в результате DOP-PCR ДНК представляет собой фрагменты размером от 200 до 1500 пар оснований, фланкированные соответствующим праймером. Метка вводится в дополнительных циклах ПЦР, проводимой с добавлением меченого дезоксинуклеотидтрифосфата, либо сразу, либо после дополнительных циклов реамплификации, позволяющей значительно увеличить количество конечного продукта за счет небольшого снижения его качества. После мечения ДНК обрабатывается ультразвуком, что обеспечивает оптимальный для проведения FISH размер фрагментов ДНК. Фрагментирование ДНК при производстве коммерческих ДНК-проб имеет еще одну цель. Она исключает возможность дополнительной амплификации ДНК пробы пользователем.
Выделение индивидуальных хромосом для генерации хромосомоспецифичных ДНК-проб может быть осуществлено и с помощью микроманипуляционной техники (методы микродиссекции метафазных хромосом, (рис. 4) [38; 42]. В дальнейшем также проводится амплификация ДНК выделенных индивидуальных хромосом и введение соответствующей метки. В настоящее время такие ДНК-пробы предлагает фирма METASystems GmbH ([ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]). В России для собственных нужд и проведения совместных исследований с другими организациями полный комплект всех хромосомоспецифичных ДНК-проб человека был получен в Институте цитологии и генетике СО РАН. Качество таких ДНК-проб при гибридизации с хромосомами человека практически не отличается от полученных из материала сортированных хромосом, но само их получение является более трудоемким и требующим более высокой квалификации исследователя. Т.е., получение хромосомоспецифичных ДНК-проб из сортированных хромосом оказалось более технологичным, что и определило их массовое производство этим способом.
В отличие от сортировки хромосом микроманипуляционная техника позволяет собирать материал не только индивидуальных хромосом, но и интересующих хромосомных районов. В настоящее время микродиссекция метафазных хромосом с последующей амплификацией ДНК в DOP-PCR представляет собой самый простой и быстрый способ получения районоспецифичных ДНК-библиотек. Пожалуй, единственной альтернативой получения ДНК-библиотек протяженных хромосомных районов является объединение искусственных хромосом дрожжей (YACов), содержащих ДНК интересующего района.
Отдельной проблемой является введение в ДНК элементов, которые позволяют визуализовать ее при микроскопии цитологического препарата. В первых экспериментах таким элементом являлся радиоактивный изотоп водорода (3Н). Препарат покрывали фотоэмульсией, и после, иногда, достаточно длительной экспозиции и обработки фотоэмульсии исследователь анализировал распределение на препарате зерен серебра. Использование радиоактивного мечения имело ряд недостатков, которые практически исключали использование гибридизации in situ в хромосомной диагностике. Замена радиоактивного изотопа водорода определенными химическими соединениями оказалось не только безопаснее, но также обеспечило более высокий уровень разрешения и открыло путь к одновременному использованию большого числа ДНК зондов, новым методам регистрации сигнала и обработки результатов in situ гибридизации. Последнее привело к появлению нового раздела цитогенетики – «количественной молекулярной цитогенетики», решению проблем которой уже было посвящено несколько крупных совещаний, таких как Euroconferences on Quantitative Molecular Cytogenetics.
Формально мечение ДНК для создания ДНК-пробы представляет собой любую модификацию ДНК, позволяющую детектировать ее на цитологическом препарате после гибридизации in situ. Принято подразделять мечение ДНК на прямое и непрямое. Прямое мечение предполагает введение в ДНК элементов, которые могут быть непосредственно визуализованы при последующей микроскопии. В случае люминесцентной или конфокальной микроскопии для мечения ДНК используют различные флуорохромы, например: флуоресцеинизотиоционат (FITC), родамин, аминометилкумарин AMCA, цианиновые красители (Cy3; Cy3.5; Cy5, Cy5.5, Cy7) и многие другие. При прямом мечении после завершения гибридизации перед проведением микроскопии требуется только отмывка оставшегося несвязанным меченого зонда. Список широко используемых флуорохромов и их спектральные характеристики можно найти на сайтах фирм, производящих микроскопическое оборудование, например на сайте CARL ZEISS (http://www.zeiss.de).
При непрямом способе мечения в качестве репортерных элементов могут быть использованы разные соединения. Наиболее широко используются биотин и дигоксигенин. Сегодня коммерчески доступен большой набор систем их детекции с помощью различных флуохромов. Очень широко, за исключением анализа тканей с высоким уровнем эндогенного биотина таких как, печень и почки, используется биотин, имеющий высокое сродство к авидину и стрептавидину (рис. 5), что позволяет использовать для его детекции их коньюгаты с различными флуорохромами. Иногда предпочтение отдается растительному алкалоиду дигоксигенину, детектируемому при помощи моноклональных антител. Он обеспечивает такую же чувствительность при детекции, как биотин, но дает более низкий уровень неспецифического связывания. Использование для непрямого мечения различных репортерных элементов также позволяет проводить FISH одновременно с несколькими ДНК пробами. Непрямой вариант мечения ДНК пробы обычно позволяет добиться уровня сигнала, в несколько раз превышающего сигнал при использовании прямомеченой ДНК-пробы при использовании одинаковых флуорохромов. Это объясняется присутствием на молекуле антитела 3-4-х молекул флуорохрома. Кроме того, в некоторых системах детекции существует возможность каскадного усиления сигнала. Например, сигнал может быть усилен последовательными обработками препарата: авидин, коньюгированный с флуорохромом, биотинилированные антитела, специфичные к авидину и авидин, коньюгированный с флуорохромом. При необходимости этап усиления сигнала может быть повторен. К сожалению, одновременно с интенсивностью сигнала растет уровень фона, что не позволяет проводить бесконечные циклы усиления. С совершенствованием микроскопической техники и техники регистрации флуоресцентного сигнала острота проблемы регистрации слабого сигнала значительно уменьшилась. Охлаждаемые CCD-камеры позволяют накапливать сигнал в течение десятков минут и надежно регистрировать очень слабую флуоресценцию. Кроме того, постоянно увеличивается число новых высокоэффективных флуорохромов. Этим обусловлена тенденция все более широкого использования прямо меченых ДНК-проб, но и сегодня при проведении FISH с одним или с двумя ДНК пробами часто используется старый, но надежный и более дешевый непрямой метод мечения ДНК.

Общие принципы молекулярно-цитогенетического анализа.
Основной задачей при проведении хромосомной диагностики является выявление хромосомных аномалий и их точное описание. Современные методы молекулярной цитогенетики позволяют сделать это двумя принципиально различными способами:
Визуализация на цитологических препаратах соответствующих последовательностей ДНК;
Создание ДНК-проб из анализируемого объекта для последующего выяснения вопроса, какие последовательности ДНК и в какой дозе они присутствуют в анализируемых хромосомах или клетках.
Гибридизация нуклеиновых кислот является основной при проведении практически любой молекулярно-цитогенетической диагностики. Существующие технологии позволяют проводить секвенирование индивидуальных геномов. Но принципиальные возможности и практическая диагностика значительно отличаются друг от друга. В практической медицине важно получить быстрый и правильный ответ на поставленный вопрос. В ряде случаев поставленный вопрос может быть предельно конкретным. Исходя из имеющихся данных, требуется определить, есть ли в клетках пациента определенная хромосомная перестройка. В современной молекулярной цитогенетической диагностике существует множество подобных случаев.

Визуализация специфичных хромосомных локусов
Примером молекулярно-цитогенетической диагностики, базирующейся на визуализация специфичных хромосомных локусов, может служить выявление делеций, ассоциированных с микроделеционными синдромами. Предпосылкой для проведения такой диагностики обычно является выявление у пациента фенотипа, соответствующего одному из микроделеционных синдромов. Размер делеции слишком мал для ее надежной регистрации рутинными методами хромосомного анализа, но проведение FISH может дать однозначный ответ на вопрос: присутствует ли в хромосоме последовательность ДНК, в норме находящаяся в районе предполагаемой делеции, либо она утеряна. Для проведения такой FISH требуется специальная ДНК-проба: меченая ДНК из района делеции. Так как такие ДНК-пробы предназначены для детекции определенных локусов хромосомы, для их обозначения обычно используют термин - идентификатор специфичных хромосомных локусов (Locus Specific Identifier – LSI). В настоящее время имеется широкий выбор коммерчески доступных ДНК-проб для проведения диагностики большинства микроделеционных синдромов. Достаточно заглянуть на сайт Abbott Molecular ([ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]), чтобы ознакомиться с огромным списком LSI. В качестве примера использования LSI можно привести детекцию микроделеций в районе 15q11q13, с которыми связаны синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана (рис. 6.). В настоящее время существует набор клонированных фрагментов ДНК (локусы D15S10, D15S15, SNRPN, GABRB3), на базе которых созданы ДНК-пробы для определения таких делеций. Так как известна их локализация в хромосоме (рис. 6), FISH таких LSI позволяет уточнять границы делеций.
FISH LSI с метафазными хромосомами и интерфазными ядрами широко используется в хромосомной диагностике и при онкологических заболеваниях. Например, при остром миелоидном лейкозе типа М2 большое значение имеет выявление транслокации t(8;21)(q22;q22). На рисунке 7 представлены схемы хромосом и рекомендуемые для проведения диагностики LSI. В норме ген AML1 (RUNX1) локализован в районе 21q22, ген ETO (CBFA2T1) в районе 8q22. В случае транслокации t(8;21)(q22;q22) происходит формирование химерного гена AML1/ETO. Таким образом, и на хромосоме der(8)t(8;21), и на хромосоме der(21)t(8;21) в районе транслокации присутствуют последовательности ДНК, гомологичные части ДНК гена AML1, и ДНК гена ETO. Проведение двухцветной FISH c LSI AML1 и LSI ETO дает одноцветные сигналы на нормальных хромосомах 8 и 21 и двухцветные сигналы на их дериватах (рис. 7). Следует заметить, что число и тип сигналов при проведении FISH не зависит от стадии клеточного цикла, что позволяет выявлять t(8;21)(q22;q22) непосредственно в интерфазных ядрах. Такие возможности проведения диагностики, отрывающиеся при использовании FISH, особенно важны в тех случаях, когда в образце практически отсутствуют делящиеся клетки, например, после проведения курса химиотерапии.
Аналогичный подход используется для выявления большинства диагностически значимых транслокаций и инверсий. К ним, несомненно, относится и филадельфийская хромосома - t(9;22)(q34;q11), и t(6;9)(p23;q34.3), t(15;17)(q22;q21.1), t(16;16)(p13;q22) или inv(16)(p13q22). Общее направление развития диагностики при гемопоэтических неоплазиях наглядно демонстрирует эволюция методов выявления inv(16)(p13q22).
Идентификация хромосомных перестроек с точками разрывов в 16р13 и 16q22 позволяет выделять определенную группу больных среди пациентов с острой миелоидной лейкемией. Хромосомные аберрации с такими точками разрывов встречаются в виде inv(16)(p13;q22), реже - t(16;16)(p13;q22). Инверсия в хромосоме 16 часто связана с FAB М4ЕО подтипом острой миелоидной лейкемии. Она также наблюдается при типе М4 без эозинофилии и в М2 подтипе. Для больных с острой миелоидной лейкемией и inv(16) только эта хромосомная аномалия имеет прогностическое значение. Следует заметить, что острая миелоидная лейкемия c inv(16) представляет собой один из самых благоприятных ее вариантов, при котором число пациентов с ремиссией более 5 лет достигает почти 50%. В то же время, среди пациентов с острой миелоидной лейкемией и inv(16) наблюдается более высокая частота рецидивов, которая, однако, может быть уменьшена при терапии более высокими, чем стандартные, дозами Ara-С.
Таким образом, надежная идентификация inv(16) имеет не только прогностическое значение, но также важна для определения стратегии химиотерапии. Использование GTG-дифференциального окрашивания хромосом оставляло открытым вопрос о ее присутствии в значительном числе случаев. Для решения этой проблемы были получены 16р и 16q специфичные ДНК-пробы. Так как перицентрическая инверсия хромосомы 16 приводит к перемещению материала из одного плеча в другое, и, соответственно, к разрыву на хромосоме в норме единого непрерывного сигнала (рис. 8) или чередованию цветов при постановке двухцветной FISH [9], ее детекция стала простой и надежной даже на хромосомных препаратах очень низкого качества. Следующий шаг стал возможным, благодаря точной локализации точек разрыва при этих хромосомных перестройках, и созданию соответствующего комплекта ДНК-проб (LSI CBFB). LSI CBFB состоит из двух клонированных фрагментов ДНК, меченых разными флуорохромами (рис. 9). Один из них расположен проксимальнее, другой – терминальнее точки разрыва, на расстоянии 50 kb один от другого. На нормальной метафазной хромосоме и в интерфазном ядре сигналы этих ДНК-проб имеют общую локализацию, тогда как на хромосоме inv(16)(p13q22) или хромосоме t(16;16)(p13;q22) они расположены далеко друг от друга (рис. 9).
Особое положение среди хромосомных перестроек, наиболее типичных при гематологических нарушениях, занимают перестройки, затрагивающие ген MLL, локализованный в районе 11q23. Выявлено более 30 вариантов транслокаций в этом районе. Наиболее часто встречаются следующие хромосомные перестройки: t(4;11)(q21;q23), t(9;11)(p22;q23) и t(11;19)(q23;p13). Более того, примерно в 25% транслокаций, вовлекающих район 11q23, имеют место делеции с точками разрывов, одна из которых расположена в локусе MLL, а вторая – более дистально. В связи с этим для анализа подобных перестроек оказалось наиболее эффективным является использование комбинации ДНК-проб из этого района, меченных разными флуорохромами [16]. В интерфазных ядрах клеток, несущих нормальные хромосомы 11, FISH с этими ДНК-пробами дает совмещенные сигналы. В клетке, несущей t(11;?)(q23;?), выявляется один сайт совмещенных сигналов (нормальная хромосома) и два сигнала разного цвета, отстоящих друг от друга на некотором расстоянии. В случае делеции части MLL выявляется один двухцветный и один одноцветный сигнал. Такой подход позволяет выяснить есть ли перестройка, затрагивающая район 11q23. Причем для этого достаточно рассмотрения результатов FISH с интерфазными ядрами. В интерфазных ядрах с одной нормальной и одной перестроенной хромосомой выявляется один совмещенный и два раздельных сигнала в случае транслокации, либо один совмещенный и один одноцветный сигнал в случае делеции.
Анализ гемопоэтических неоплазий показал, что их классификация позволяет выделять не отдельные заболевания, а скорее группы сходных заболеваний, которые, тем не менее, могут отличаться по своей этиологии, механизму лейкемиегенеза и прогнозу развития. В качестве примера ниже рассмотрим острые лейкемии. Они могут быть классифицированы в соответствии с их морфологическими, иммунофенотипическими и цитогенетическими характеристиками. Эти три метода классификации были объединены в единую MIC классификацию (morphological, immunological, cytogenetic), включающую в себя FAB (French-Amercan-British) морфологическую классификацию, которая разделяет острые миелолейкемии на семь или восемь групп, а острые лимфолейкемии на три группы. MIC классификация обеспечивает более детальное подразделение острых лейкемий и позволяет введение новых групп при проведении дальнейших исследований [5]. Для классификации лимфобластных лейкемий огромное значение играет проведение иммунологического и цитогенетического анализа. При классификации острых миелоидных лейкемий большое значение имеют морфологические и кариотипические исследования. Определение иммунофенотипа существенно только для опознавания острой мегакариобластной лейкемии М7 и М0 типа острой миелоидной лейкемии. Определение хромосомных аномалий может служить как для подтверждения анализа, так и для его постановки. Примером последнего служит диагностика гипогранулярного варианта М3 типа острой миелоидной лейкемии при выявлении t(15;17).
Цитогенетический анализ позволяет определять случаи клональной эволюции связанные с ухудшением прогноза, например обнаружение кариотипических аномалий в случаях миелодисплазивного синдрома. Об ухудшение прогноза свидетельствует и выявление новых хромосомных аномалий при хронической гранулоцитной лейкемии. Во время бластного криза значительная часть пациентов имеют вторичные кариотипические аномалии. Рецидивы миелобластной лейкемии часто связаны с появлением клеток с новыми кариотипическими аномалиями. Интересно отметить различия дополнительных кариотипических нарушений, имеющих место при лимфобластной и миелобластной трансформациях, что, вероятно, является следствием реализации различных генетических механизмов клеточной трансформации.
Описанный подход к анализу хромосомных патологий методом гибридизации in situ специально разработанных для этих целей ДНК-проб с интерфазными ядрами применим и при проведении диагностики в случае солидных опухолей.

Визуализация материала индивидуальных хромосом
К сожалению, далеко не всегда задача, стоящая перед хромосомной диагностикой, поставлена так четко. Часто существует необходимость провести анализ кариотипа, в который включает рассмотрение всех хромосом. Наиболее эффективным в этом случае является 24-х цветная FISH и сравнительная геномная гибридизация (Comparative Genome Hybridization - CGH). Первая позволяет эффективно выявлять транслокации хромосом, но мало пригодна для анализа небольших делеций и дупликаций, и совсем непригодна для выявления парацентрических инверсий. Сравнительная геномная гибридизация позволяет выявлять нарушение в клетках баланса районов и целых хромосом, но не может быть использована для детекции транслокаций и инверсий. Детальному рассмотрению принципов, на которых основана CGH, возможностям и ограничениям ее использования будет посвящен следующий раздел этой книги, а в этой главе мы рассмотрим методы визуализации целых хромосом.
CISS-гибридизация хромосомоспецифичной ДНК-пробы окрашивает материал соответствующей хромосомы вне зависимости от ее целостности. Однако необходимо учитывать, что супрессия повторенных последовательностей, необходимая в этом случае, может приводить к полному подавлению гибридизации меченой ДНК в С-позитивных районах хромосом, содержащих, в основном, повторенные последовательности. Также существует проблема выявления небольшого района исходной хромосомы (менее одного бэнда), перенесенного в другую хромосому. Результаты такой FISH помогут в выявлении только перицентрических инверсий и только при условии заметного изменения морфологии хромосомы в результате смещения положения центромеры. К сожалению, FISH с хромосомоспецифичными ДНК-пробами не эффективена также для выявления делеций и дупликаций небольших районов. В этих случаях перестроенная хромосома окрашивается полностью, и аномалия может быть выявлена только в результате анализа ее Q-бэндинга, который по качеству обычно уступает GTG-дифференциальной окраске.
Многоцветная FISH
FISH отдельных хромосомоспецифичных ДНК-проб эффективен при проверке уже возникших подозрений. Для полного кариотипирования требуется одновременное проведение FISH со всеми хромосомами человека. Т.е., необходимо одновременно провести гибридизацию с 24-мя ДНК-пробами (22 пары аутосом, половые хромосомы X и Y) и иметь возможность их одновременной детекции. К сожалению, в настоящее время невозможно подобрать комплект из 24-х флуорохромов, неперекрывающихся по эмиссионному спектру. Решение проблемы было найдено благодаря применению комбинаторного мечения ДНК. Его принцип заключается в мечении хромосомоспецифичной ДНК-пробы не одним, а набором флуорохромов. Использование «n» флуорохромов обеспечивает 2n-1 уникальных вариантов мечения ДНК-проб. Т.е., уже пять флуорохромов обеспечивает 31 вариант мечения, что с избытков покрывает все потребности одновременного мечения хромосомы человека. В 1996 году при разработке 24-цветной FISH было реализовано два технических решения по анализу результатов гибридизации in situ комбинаторно меченых ДНК-проб. Одно из них базировалось на последовательной регистрации сигналов отдельных используемых флуорохромов с последующей компьютерной обработкой полученной информации (multiplex FISH - M-FISH) [43]. Альтернативное решение было найдено благодаря развитию техники спектрального анализа, которая позволяла получать спектральную кривую для каждой точки анализируемого микроскопического изображения (спектральное кариотипирование – SKY). Анализ полученных кривых позволял определять, какие флуорохромы присутствовали в каждой точке [40]. Рассмотрим более подробно эти методы.
Несмотря на то, что в современной терминологии постоянно используются слова с корнем «цвет», при регистрации микроскопических изображений, полученных в результате проведения M-FISH, используются монохромные (черно-белые) камеры. Спектральная характеристика регистрируемого сигнала определяется комплектом фильтров, и использование цветной камеры может только значительно снизить чувствительность системы регистрации сигнала. Т.е., на практике проводится регистрация сигнала в разных каналах, и основной задачей организации микроскопии является наряду с обеспечением необходимого уровня чувствительности исключение регистрации сигналов флуорохромов, посторонних для данного канала. Для удобства и простоты представления и восприятия результатов регистрации сигналов в соответствующих каналах при их одновременном выведении на монитор компьютера или твердый носитель (печать на бумаге) используются псевдоцвета. Т.е., сигналу каждого канала присваивается определенный псевдоцвет. Псевдоцвет может не иметь ничего общего с реальным цветом флуорохрома. Например, в статьях часто можно встретить окраску хромосом красителем DAPI, представленную красным цветом. Это обусловлено тем, что при печати на бумаге комбинация красного и зеленого позволяет проще показать больше деталей, чем комбинация синего и зеленого.
Благодаря большим успехам в разработке новых флуорофоров в настоящее время возможно собрать несколько вариантом для комбинационного мечения. Один из таких вариантов для M-FISH приведен на рисунке 10. Использовали пять флуорохромов для мечения хромосомоспецифичных ДНК-проб (FITC, Spectrum Orange, TexRed, Cy5, DEAC) и шестой флуорохром (DAPI) для общей окраски хромосом. Регистрация сигналов в шести каналах при проведении M-FISH показана на рисунке 11. Дальнейшая компьютерная обработка, проведенная с помощью специализированного программного обеспечения, позволяет сформировать новые типы псевдоцветов, соответствующих конкретным хромосомам. Например, точке, где одновременно представлены сигналы DAPI, FITC и Cy5, присваивается псевдоцвет хромосомы 6. При выявлении дополнительно к ним сигнала флуорохрома DEAC, - псевдоцвет хромосомы 16 (рис. 10). Таким образом, формирование 24-х псевдоцветов позволит идентифицировать материал всех хромосом человека.
Такой же принцип формирования псевдоцветов и идентификации материала хромосом человека используется при спектральном кариотипировании. Эти методы отличают технические решения, использующиеся при идентификации флуорохромов, присутствующих в каждой из точек препарата. При спектральном кариотипировании для каждой точки микроизображения снимается полная спектральная характеристика. Процесс осуществляется с помощью приборной базы «Spectral Imaging», которая хорошо зарекомендовала себя ранее в промышленности и в разнообразных исследованиях, требующих точного описания спектральных характеристик объекта. Она позволяет в ходе одного измерения получать спектральные кривые для всех точек изображения, вне зависимости от того, связано ли это с флуоресценцией или с традиционной световой микроскопией. Такой способ регистрации сигнала оказался менее чувствителен к вариациям интенсивности сигналов и позволил достичь лучшего отношения сигнал / шум. При спектральном кариотипировании хромосом человека также, как при M-FISH, для создания ДНК-проб используют пять флуорохромов: один работает в зеленой области спектра, два - в красной и два - в инфракрасной. Возбуждение и эмиссия всех этих флуорохромов происходит при одном комплекте фильтров, что позволяет избежать последовательной смены фильтров, промежуточных фокусировок, а, следовательно, и связанных с ними таких проблем, как пространственный сдвиг изображения, определение пороговых значений и использование сегментационных масок. В одном акте экспозиции полная спектральная характеристика испускаемого света записывается одновременно для каждой точки изображения. На основании анализа спектральных кривых определяется наличие или отсутствие в данной точке конкретных флуорохромов. Следующим шагом является процедура классификации, выполняемая с помощью специального программного обеспечения, которое позволяет определять хромосомную принадлежность анализируемого материала. Это обеспечивает надежную идентификацию (с точностью до хромосомы) материала нормальных хромосом, а также дериватов хромосом, возникших в результате разнообразных перестроек. Большим достоинством метода SKY является то, что параллельно анализу спектральных характеристик регистрируется окрашивание флуорохромом DAPI, которое после обработки специальной программой улучшения изображения достигает по своему качеству уровня дифференциальной исчерченности хромосом, получаемой при GTG-дифференциальном окрашивании. Возможность параллельного анализа результатов SKY и качественной дифференциальной окраски позволяет более точно определять точки разрывов при хромосомных перестройках. К несомненным достоинствам SKY относится возможность использования флуорохромов с перекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии, что расширяет список веществ, пригодных к использованию в SKY.
Несмотря на огромные возможности 24-х цветной FISH ее применение имеет свои ограничения. Естественно, все ограничения использования отдельных хромосомоспецифичных ДНК-проб распространяются и на их комплексное использование. Это касается упоминавшихся ранее инверсий, небольших делеций и дупликаций. К сожалению, существуют также дополнительные проблемы, связанные с комбинаторным мечением и одновременной гибридизацией большого числа ДНК-проб. Так как, по крайней мере, для части хромосом, ДНК-пробы которых мечены двумя или тремя флуорохромами, при проведении 24-х цветной FISH имеет место конкуренция за места гибридизации фрагментов ДНК, конъюгированных с разными флуорохромами. Это, естественно, приводит к падению интенсивности сигнала отдельных флуорохромов. Феномен уменьшения чувствительности 24-х цветной FISH при выявлении небольших районов хромосомы относительно FISH с хромосомоспецифичными пробами без использования комбинаторного мечения хорошо известен цитогенетикам. Другая проблема связана с особенностями приготовления препаратов метафазных хромосом. В ходе их приготовления ДНК хромосомного района распластывается во всех направлениях, что обуславливает перемешивание ДНК разных районом хромосом, примыкающих к точке разрыва/соединения хромосом. В связи с этим в районе контакта после проведения 24-х цветной FISH присутствуют флуорохромы, которые были использованы для мечения обоих хромосом. При некоторых транслокациях этот феномен может приводить проблемам в интерпретации полученных результатов. Рассмотрим некоторые из них, возникающие при варианте мечения, представленном на рисунке 10:
1. Транслокация хромосом 1 и 2. При транслокации возникает район, по сигналу флуорохромов соответствующий материалу хромосомы 7. Отличить такую имитацию от реальной инсерции небольшого района хромосомы 7 достаточно сложно. В случае t(1;2;7) произойдет лишь небольшое расширение района, окрашиваемого псевдоцветом, соответствующим хромосоме 7.
2. Инсерция небольшого района хромосомы 1 в хромосому 7. Инсерция размером менее 10 млн. пар оснований не выявляется, так как материал инсерции будет «прикрыт» материалом хромосомы 7.
3. Транслокация небольшого терминального района хромосомы 1 в хромосому 7. Транслокация размером менее 10 млн. пар оснований не выявляется по тем же причинам, что и рассмотренная выше инсерция.
4. При эффективной супрессии гибридизации повторенных последовательностей не определяется происхождение С-позитивных районов хромосом.
Проведение сравнения эффективности использования M-FISH и SKY сталкивается с рядом проблем. Качество результатов, полученных с помощью этих технологий, в значительной степени зависят от конкретной комплектации используемого оборудования и качества ДНК-проб. При этом приходится признать, что недостатки или проблемы использования каждой из технологий являются продолжением их достоинств и преимуществ. Например, полная автоматизация классификации псевдоцветов при использовании SKY позволяет исключить человеческий фактор, но в случае сложных хромосомных перестроек, включающих небольшие хромосомные районы, оказывается очень сложно или даже невозможно провести настройку системы для решения конкретной проблемы. При M-FISH исследователь имеет в своем распоряжении огромные возможности настройки классификатора псевдоцветов, задавая пороговые значения сигнала или в «ручную» анализируя имиджи, полученные при регистрации отдельных флуорохромов. Это позволяет провести более детальный анализ конкретной перестроенной хромосомы и прийти к более обоснованному заключению. Однако, в этом случае существенно возрастает ответственность исследователя, и огромную роль начинают играть его индивидуальные качества. Собственный опыт диагностики сложных хромосомных перестроек с использованием M-FISH и SKY [19] может быть обобщен следующим образом: SKY более удобен при проведении стандартной диагностики, но M-FISH предоставляет больше возможностей для анализа аномальных хромосом, в состав которых входят небольшие (менее 10 МВ) районы разных хромосом.
Рассматривания варианты многоцветной FISH необходимо отметить существующую сегодня возможность проведения 42-х цветной FISH, которая позволяет идентифицировать материал всех плеч хромосом человека за исключение коротких плечей актоцентрический хромосом и Y-хромосомы []24]. Для ее проведения требуется использование 18-ти дополнительных ДНК-проб, специфичных плечам хромосом, шести флуорохромов для комбинаторного мечения 42-х ДНК проб и микроскопическое оборудование позволяющее раздельно регистрировать сигналы семи флуорохромов.
Межвидовое цветное сегментирование хромосом (RxFISH)
Использование в 24-х цветной FISH хромосомоспецифичных ДНК-проб человека позволяет определять происхождение районов хромосом размером более 10 МВ, но, как уже обсуждалось выше, практически исключает возможность анализа большинства внутрихромосомных перестроек. Для их анализа требуются ДНК-пробы, специфичные не целым хромосомам, а их отдельным районам. В качестве таких проб были использованы комбинации WCP двух видов гиббонов [33; 34]: Hylobates concolor и Hylobates syndactylus. Сегментационное окрашивание хромосом человека при использовании WCP гиббонов обусловлено многочисленными межхромосомными перестройками, различающими хромосомы человека и гиббонов. Разработанный метод получил название RxFISH. В отличие от 24-цветной FISH, он позволяет выявлять часть внутрихромосомных перестроек. ДНК-пробы, используемые в RXFISH, мечены комбинацией 3-х флуорохромов, что обеспечивает всего лишь 7 псевдоцветов. В эти цвета окрашиваются отдельные сегменты хромосом человека, создавая цветную исчерченность хромосом (рис. 12). Очевидно, что, несмотря на всю фантастичность картины RXFISH, использование этого метода имеет достаточно серьезные ограничения: перестройки хромосом, имевшие место внутри одного цветного RX-бэнда, не могут быть выявлены с помощью этого метода, если они не приводят к значительным и легко видимым изменениям его размера. Комплексные хромосомные перестройки часто также оказываются за пределами возможностей использования этого метода из-за небольшого числа псевдоцветов, описывающих хромосомные районы.
К недостаткам RXFISH можно отнести большой размер многих цветных районов. А такие хромосомы, как 15, 18, 19, 21, 22, X и Y представляют собой один цветной бэнд каждая. Использование в будущем большего числа флуорохромов и новых ДНК-проб, полученных благодаря использованию искусственных хромосом или микродиссекции метафазных хромосом, может значительно повысить разрешающую способность данного метода.

Многоцветный бэндинг хромосом (Multi Color Banding - MCB).
В отличии от 24-х цветной и RxFISH метод многоцветного окрашивания хромосом человека предназначен для детального анализа индивидуальных хромосом [8]. В его основе лежат микродиссекционные районоспецифичные ДНК-библиотеки, многоцветная FISH, цифровая видеозапись микроизображений и их специализированная обработка. Цифровая запись микроизображений и компьютерная обработка позволяют перевести в псевдоцвета не только комбинации флуорохромов, но и соотношения их интенсивностей. Данная система была разработана сотрудниками Института генетики человека Университета города Йены (профессор Уве Клауссен, доктор Ильза Худоба) в сотрудничестве с фирмой MetaSystems GmbH.
Комплекты микродиссекционных ДНК-библиотек для МСВ всех хромосом человека были получены Институтом генетики человека Йенского Университета в сотрудничестве с Институтом цитологии и генетики СО РАН. Аналогичные микродиссекционные ДНК-пробы также коммерчески доступны в фирме MetaSystems GmbH ([ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]). Комплект ДНК-проб для индивидуальной хромосомы представляет собой набор микродиссекционных ДНК-библиотек, каждая из которых обеспечивает необходимый профиль интенсивности сигнала в пределах соответствующего хромосомного района. Уровень сигнала каждой из микродиссекционных районоспецифических ДНК-библиотек варьирует по интенсивности, достигая максимума в центре и постепенно падая практически до нуля на его границах. Мечение ДНК-библиотек флуорохромами проводится таким образом, чтобы после FISH не возникало одинаковых комбинаций флуорохромов в разных хромосомных районах. Перекрывание профилей интенсивности сигналов ДНК-проб обеспечивает вариации соотношений интенсивностей флуоресценции различных флуорохромов вдоль хромосомы. В результате программной обработки изображения каждому из хромосомных районов, характеризующихся уникальной комбинацией сигналов разных флуорохромов присваивается свой псевдоцвет (рис. 13). Программное обеспечение, необходимое для обработки микроизображений и генерации МСВ, в настоящее время входит в пакеты программ фирмы MetaSystems GmbH.
Метод МСВ дает идентичный цветной «bar-код» на хромосомах различного уровня конденсации, что обеспечивает высокий уровень разрешения даже при анализе высококонденсированных хромосом и хромосом с нечеткой морфологией, характерных для цитологических препаратов малигнизированных клеток. При анализе аномальных хромосом, содержащих участок анализируемой хромосомы, возможно определение его локализации, а в случае достаточного размера и его ориентации. При анализе маркерной хромосомы, состоящей из участка анализируемой хромосомы, МСВ, отличие от традиционных методов M-FISH, позволяет провести не только определение хромосомного происхождения, но и идентификацию хромосомных районов, формирующих маркерную хромосому, и определить их ориентацию [19].

Обратная цитогенетика
Альтернативно прямой молекулярно-цитогенетической диагностике, основанной на гибридизации стандартных ДНК-проб с хромосомами или интерфазными ядрами клеток пациента, может быть использовано создание оригинальной ДНК-пробы из интересующего образца с последующим ее изучением. Такая ДНК-проба может представлять собой как меченую геномную ДНК интересующих исследователя клеток (раковые клетки), так и ДНК анализируемой аномальной хромосомы. Если геномная ДНК используется в сравнительной геномной гибридизации, чему будет посвящена отдельная глава, то FISH ДНК-пробы с нормальными хромосомами или со специальными чипами позволит определить нарушения баланса хромосомных районов. FISH ДНК-пробы аномальной хромосомы с метафазными хромосомами пациента и здорового донора позволит просто и надежно определить состав аномальной хромосомы. Теоретически создание ДНК-пробы аномальной хромосомы возможно разными способами: микроманипуляционный сбор одной или нескольких копий аномальной хромосомы; получение культуры клеток и последующий сортинг метафазных хромосом; получение гибридов соматических клеток, содержащих только одну хромосому человека, которая и интересует исследователя. В практической диагностике используется только первый из них. Он позволяет сделать заключение о составе аномальной хромосомы в течение трех дней. В первый день проводится микроманипуляционный сбор материала, его обработка и DOP-PCR. На следующий день проводится мечение продукта DOP-PCR и постановка FISH с метафазными хромосомами пациента и здорового донора. Следующим утром проводится отмывка препаратов и детекция меченой ДНК, если использовалось непрямое мечение. В этот же день проводится микроскопический анализ, по результатам которого делается окончательное заключение. Описанный метод имеет ряд несомненных достоинств. Он позволяет определять не только происхождение хромосомный районов, но также позволяет дать их достаточно точное описание. Опыт его использования показал, что он имеет более высокую чувствительность при выявлении небольших транслокаций и инсерций при анализе сложных хромосомных перестроек [19]. К сожалению, есть ряд проблем, с которыми исследователь встречается при его применении. Основным условием его успешного использования является необходимость идентификации интересующей хромосомы при проведении микроскопического анализа. В связи с этим обычно проводится микродиссекция GTG-окрашенных хромосом. Рассмотрим один из типичных примеров. В результате проведения стандартного хромосомного анализа пациента в медико-генетической консультации в г. Новосибирске была выявлена аномальная хромосома, описанная 3р+ [1]. Создание ДНК-пробы из 3р+ хромосомы с последующей ее гибридизации с хромосомами пациента и здорового донора (рис. 14) позволило определить ее состав и описать кариотип пациента как mos 46,XY,der(3)t(3;10)(3p25;q24.3)[69]/46,XY[31].
Выявленный мозаицизм и отсутствие каких-либо хромосомных патологий у родителей носителя «3р+» позволяют с уверенностью говорить о возникновении данной хромосомной перестройки de novo. Присутствие der(3)t(3;10)(3p25;q24.3) более, чем в двух третях клеток приводит к мозаицизму по частичной моносомии 3р (дистальная часть района 3р25) и частичной трисомии 10q (район 10q24.3(qter). Насколько нам известно, приведенный в настоящей статье случай является первым примером частичной трисомии 10q и частичной моносомии 3р, возникшими de novo. Механизм формирования данной хромосомной перестройки неясен. Мозаицизм по присутствию аномальной хромосомы, высокий процент клеток клона с хромосомой 3р+, значительные отклонения в развитии ребенка указывают на то, что реорганизация хромосом имела место на ранних этапах пренатального развития. В качестве одного из возможных предположений, объясняющих появление аномального клона, можно предложить транслокацию хромосомного материла 3-ей и 10-ой хромосом с последующим нарушением расхождения хромосом в митозе, приведшим к потере der(10) и унипарентной родительской дисомии нормальной хромосомы 10. Следует отметить, что отсутствие у пациента характерных для частичной моносомии 3р дефектов сердечнососудистой системы указывает на локализацию точки разрыва дистальнее локусов D3S1585 и D3S1263 в коротком плече 3-ей хромосомы [11; 25].
Проведение подобного анализа значительно осложняется в случае, если дифференциальная окраска хромосом не позволяет надежно определить аномальную хромосому. Одним из примеров такой диагностики является проведенный нами анализ аномальной хромосомы 6. В результате стандартной процедуры кариотипирования в было высказано предположение, что приблизительно в 30% клеток один из гомологов хромосомы 6 имеет аномалию длинного плеча. Для постановки окончательного анализа было собрано три копии аномальной хромосомы, получена ДНК-проба и проведена FISH с метафазными хромосомами, по результатам которого аномальная хромосома была описана как del(6)(q23.127) (рис. 15). Неожиданным результатом проведения такого анализа оказалось наличие хромосомы del(6) во всех клетках пациента. Т.е., приблизительно в 70% клеток при анализе GTG-дифференциально окрашенных хромосом аномалия хромосомы 6 оставалась незамеченной [38].
Для идентификации аномальной хромосом с целью ее последующей микродиссекции может быть использовано предварительное проведение FISH соответствующей ДНК-пробы [12]. В качестве альтернативного варианта создания ДНК-проб могут быть получены отдельные ДНК-пробы из гомологичных хромосом, выделенных из одной и той же метафазной пластинки.
В ряде случаев создание ДНК-проб аномальных хромосом методом микродиссекции с последующей DOP-PCR может оказаться решением в казалось бы безысходной ситуации почти полного отсутствия метафаз на цитологическом препарате. К сожалению, с такой проблемой периодически сталкивается большинство цитогенетических лабораторий. Примером могут служить хромосомная диагностика после проведения химиотерапии, отсутствие нормального роста клеток при пренатальной диагностике и т.д.. Одним из таких случаев явилось проведение цитогенетического скрининга у проживающих в удаленных от транспортных магистралей районах севера Сибири. Транспортировка образцов крови заняла более трех дней, что обусловило крайне низкое качество хромосомных препаратов у части пациентов (две три метафазы очень низкого качества на препарат). Тем не менее, специалистам Института генетики человека Томского Научного Центра СО РАМН (зав. лабораторией цитогенетики проф. С.А. Назаренко) удалось обнаружить у одного из пациентов три аномальные хромосомы. Для их описания в ИЦиГ СО РАН методом микродиссекции и последующей DOP-PCR были получены ДНК-пробы аномальных хромосом и проведена FISH со стандартными метафазными хромосомами человека. В результате было показано присутствие у пациента сбалансированной транслокации t(6;15) (рис. 16а) и кольцевой хромосомы r(14) (рис. 16б).

Комплексный молекулярно-цитогенетический анализ хромосомных патологий
Возможности молекулярно-цитогенетического анализа реорганизации хромосом значительно расширяются при использовании всего комплекса методов. Примером такого анализа может служить хромосомная диагностика, выполненная для одного из пациентов Новосибирской областной клинической больницы с острой миелолейкемией (AML)[19]. Для полного описания кариотипа были использована 24-х цветная FISH в варианте мультиплексной FISH (рис.17) и SKY (рис.18), многоцветный хромосомный бэндинг (рис.19), создание микродиссекционных ДНК-проб аномальных хромосом (рис. 20). В результате проведенной диагностики кариотип данной AML был описан следующим образом:
40~44,XY,der(1)t(1;5;8;20)(1qter1p12::5q14.35q15 or 5q15q14.3: :8p11.2 8p23?3::20p11.120p13),del(2)(q12),der(3)t(3;6),der(5)t(5;18)(5p15.33 5q11: :18q21.318q23),del(6),-8,der(9)t(9,17,15),der(10)t(3;10),del(11)(q24),-15,-16,del(17), der(18)t(8;18;5;2;20)(8q24.38q24.2 or 8q24.28q24.3::18p11.2218q21.3: :5q14.35q11::2q322q12::2013.220q13.33), der(20)t(1;20;18)(1p36.33 1p31.3-22.3::20q11.120q11.2 or 20q11.220p11.1::18p11.2218p11.32).
Благодаря комплексному подходу удалось исправить ошибки в идентификации материала небольших транслоцированных районов хромосом, возникшие после использования 24-х цветной FISH, определить локализацию точек разрывов и ориентацию траслоцированных районов.

Особенности цитогенетического анализа малых сверхчисленных маркерных хромосом человека
Одним из наиболее сложных для диагностики случаев хромосомных патологий являются малые сверхчисленные маркерные хромосомы. Выбор стратегии при проведении хромосомного анализа и используемых методов зависит от задач и типа доступного материала. При проведении пре- и постнатальной диагностики обычно есть возможность получения качественных препаратов метафазных и прометафазных хромосом. Это определяет использование на первом этапе диагностики траниционных методов дифференциального окрашивания. При выявлении аномальной хромосомы наиболее обычной задачей является либо проверка возникших в ходе диагностики гипотез, либо определение оставшегося идентифицированным хромосомного материала. Малые сверхчисленные маркерные хромосомы (small supernumerary marker chromosomes - SMCs) человека в большинстве случаев относятся ко второму варианту. Исключение представляют i(5p), i(9p), i(12p,) i(18p). Благодаря их значительным размерам их идентификация не представляет особых проблем даже при использовании цитологических методов анализа (GTG-дифференциальное окрашивание). Более того, их присутствие приводит к тетрасомии по большому числу генов и к формированию многочисленных ВПР. Типичная морфология и фенотип носителя позволяет сделать обоснованное предположение.
Остальные SMCs занимают среди хромосомных патологий человека особое место, определение происхождения и состава которых методами классической цитогенетики лежит полностью за пределами их возможностей. Маркерные хромосомы могут быть разделены на несколько групп, которые значительно различаются как по влиянию на фенотип пациента, так и по методам, которые следует использовать при проведении диагностики:
SMCs, не содержащие эухроматиновые сегменты хромосом (возможно присутствие ядрышкобразующих районов);
SMCs, содержащие эухроматиновые сегменты хромосом;
SMCs с «неоцентромерами»;
SMCs, содержащие материал двух или более хромосом.
Функционально активная центромера является неотъемлемой частью любой хромосомы. Кроме центромеры, SMCs содержат фланкирующие ее кластеры повторяющихся последовательностей, которые необходимы для ее функционирования. Минимальные размеры центромеры и фланкирующих повторяющихся последовательностей определяют минимальный размер SMCs. Увеличение ее размеров за счет районов прицентромерного С-гетерохроматина или ядрышкобразующих районов (ЯОР) не имеет клинических проявлений. Известны многочисленные примеры таких SMCs, не оказавших заметного влияния на фенотип носителя и семейные SMCs, передающиеся в ряду поколений [14]. По некоторым оценкам семейные SMCs составляют до 40% всех выявленных SMCs [15]. Отсутствие клинических проявлений таких SMCs кажется вполне логичным, так как они не содержат работающих генов. Однако, формирование SMCs может являться косвенным указанием на повышенную хромосомную нестабильность и на необходимость проведения более тщательного цитогенетического анализа. Примеры множественных SMCs, имеющих различное происхождение, хорошо согласуются с этим предположением [47].
Места хромосомных перестроек обычно связаны с наличием в них повторяющихся последовательностей [39]. Наиболее крупные кластеры дуплицированных последовательностей характерны для сегментов хромосом, расположенных на границе эу- и гетерохроматина [20]. Более мелкие кластеры выявлены в прителомерных и интерстициальных районах хромосом [20]. Присутствие в SMCs дуплицированных последовательностей может не иметь клинического значения, но осложнять идентификацию материала, входящего в состав SMCs .
Наиболее распространенными являются SMCs, возникновение которых связано с акроцентрическими хромосомами (около 80%). Наиболее часто встречаются производные хромосомы 15 (около 60%) [6]. Они найдены как в выборке фенотипически нормальных индивидов, так и среди индивидов с задержкой умственного развития. Часто в их состав входят две копии коротких плеч хромосомы 15, находящихся в инвертированной ориентации: inv dup(15). Детальный анализ inv dup(15) показал, что они являются дицентриками с инактивированной центромерой [49]. Материал, локализованный между центромерами, может содержать эухроматиновые сегменты хромосом.
Большинство SMCs, ассоциированных с врожденными пороками развития (ВПР), характеризуются наличием эухроматиновых сегментов хромосом, независимо представляют ли они бисателлитные, кольцевые, или другие варианты SMCs [49]. Конкретное содержание эухроматиновых сегментов хромосом SMCs определяет их клиническое значение. Таким образом, детекция эухроматиновых сегментов хромосом SMCs и идентификация их материала является основной задачей цитогенетической диагностики.
Задача сводится к идентификации материала SMCs и локализации точек разрывов, имевших место при их возникновении. Именно их решение позволяет дать достаточно обоснованный прогноз. К сожалению, и в этом случае он носит вероятностный характер, что может быть обусловлено присутствием различных аллелей генов, входящих в состав данной SMCs, мозаицизмом SMCs, однородительской диссомией (uniparental disomy - UPD) по хромосоме, из которой возникла SMCs .
Сходные проблемы стоят перед исследователем при анализе SMCs с неоцентромерой (центромера, не содержащая альфоидной ДНК) [4]. Механизм возникновения и функционирование неоцентромеры остаются невыясненными до настоящего времени. Практически все выявленные SMCs этого типа содержали эухроматиновый материал, идентифицированный как различные интерстициальные эухроматиновые сегменты хромосом [4]. Исключения составили SMCs с неоцентромерой, для которых не удалось определить происхождение. В этих случаях положительного результата не дали ни FISH центромероспецифичных ДНК-проб, ни ДНК-проб, специфичных прителомерным районам хромосом, ни хромосомоспецифичных ДНК-проб человека (Whole Chromosome Paint – WCP). Обратная гибридизация in situ ДНК-пробы, полученной из SMC, дающая интенсивный сигнал на SMC, не окрашивала другие районы хромосом пациента (рис. 21).
Особым типом сверхчисленных SMCs являются хромосомы, содержащие материал двух или более хромосом. Примером могут служить der(21)t(?;21)(?;p11.2) [20] или der(22)t(11;22)(q2306;q11.202)mat (не опубликованные данные).
Реальные возможности диагностики малых сверхчисленных SMCs появились благодаря развитию методов молекулярно-цитогенетического анализа [15], в основном, различным вариантам FISH. Рассмотрим основные методы, которые использовались в прошлом и обычно используются в настоящее время:
Анализ альфоидной ДНК центромерного района маркерной хромосомы [53].
FISH ДНК-проб, специфичных прицентромерным и прителомерным районам хромосом c метафазными хромосомами пациента, включая 24-цветную cenM-FISH [36].
PRINS-мечение прицентромерных и теломерных последовательностей ДНК [7].
CISS-гибридизация WCP c метафазными хромосомами (хромосомный пэйнтинг) пациента, включая 24-цветную FISH (M-FISH, SKY) [22; 45].
Сравнительная геномная гибридизация [32].
FISH клонированных уникальных последовательностей [23; 32].
Изоляция SMCs в гибриде соматических клеток и ее дальнейший анализ, включающий клонирование и секвенирование ДНК SMCs [37].
FISH меченой ДНК-библиотеки SMC с хромосомами пациента и здорового донора (получение ДНК-библиотеки изоляцией SMCs методом микродиссекции или хромосомного сортинга и последующей амплификацией ДНК SMCs в полимеразной цепной реакции с частично вырожденным праймером) [3; 35].
FISH меченой ДНК-библиотеки SMC со специализированными биочипами для определения точек разрыва с высоким разрешением.
Оценка клинического значения SMCs и в настоящее время остается одной из наиболее сложных задач хромосомной диагностики, поэтому интересно и поучительно рассмотреть развитие методов анализа этих хромосомных аномалий. Перечисленные выше методы можно разбить на три группы. Одни методы позволяют определить происхождение хромосомы, выявляя в SMCs последовательности, специфичные для определенных хромосом человека. К этой группе можно отнести методы идентификации прицентромерных районов SMCs с помощью FISH ДНК-проб, специфичных прицентромерным районам индивидуальных хромосом, и PRINS-мечение прицентромерных районов и хромосомный пэйнтинг. В другую группу входят методы, позволяющие идентифицировать эухроматиновый материал SMCs по нарушению его представленности в геноме пациента (CGH и microarray CGH). В третью группу входят методы получения ДНК-библиотек SMCs и определения состава их ДНК с помощью FISH полученной ДНК-пробы с хромосомами пациента и здорового донора (обратный пэйнтинг), со специализированными биочипами для определения точек разрыва с высоким разрешением, либо клонирование и последующее секвенирование ДНК SMCs . Каждый из этих подходов имеет свои преимущества и недостатки.
В практической диагностике наиболее широко используются методы первой группы. Они наиболее просты и доступны, но, к сожалению, малоинформативны. Информации о происхождении SMC обычно оказывается не достаточно для выводов о ее клиническом значении. Для завершения полноценного обследования необходимо выяснение вопроса, присутствуют ли в составе SMCs, а если да, то какие именно, эухроматиновые сегменты хромосомы. FISH ДНК-проб, специфичных прицентромерным районам хромосом c метафазными хромосомами пациента или PRINS-мечение прицентромерных последовательностей, определяя хромосомное происхождение центромеры SMCs, лишь указывают на дальнейшее направление исследований, в которых должны быть использованы ДНК-пробы, представляющие собой клонированные фрагменты прилежащих эухроматиновых районов. К сожалению, этот более информативный этап исследований и сегодня не является рутиной диагностической процедурой. В то же время, об огромном значение такого анализа свидетельствуют данные о различном влиянии на фенотип пациента SMCs, лишь незначительно отличающихся по входящим в их состав эухроматиновым сегментам исходной хромосомы.
Необходимо также отметить, что в случае SMCs , содержащих материал двух или более хромосом, определение происхождения прицентромерного района не дает никаких указаний на происхождение остального материала SMCs.
При разработке методов диагностики SMCs большие надежды возлагались на FISH хромосомоспецифичных ДНК-проб c метафазными хромосомами пациента. Разработка 24-цветной FISH (M-FISH, SKY), которая в одном эксперименте позволяет визуализировать материал всех хромосом человека, частично решила эту проблему [22; 45]. Однако, как уже обсуждалось выше, при использовании 24-цветной FISH необходимо учитывать несколько моментов:
а) в результате проведения CISS-гибридизации не окрашиваются ни центромеры, ни прицентромерные С-гетерохроматиновые районы, т.е., в отсутствии детектируемых эухроматиновых районов, M-FISH и SKY не дают возможности определить даже происхождение SMCs ;
б) детекция небольших эухроматиновых районов (размером до нескольких миллионов пар оснований) с помощью M-FISH и SKY проблематична, что не позволяет делать однозначного вывода об отсутствии эухроматинового района в составе SMCs , даже при полном отсутствии на ней сигнала после проведения 24-цветной FISH [26].
Чувствительность использования хромосомоспецифичных ДНК-проб может быть повышена их раздельным использованием, но это значительно повышает трудоемкость исследования, число необходимых для него цитологических препаратов и стоимость диагностики. Перечисленные выше проблемы могут быть, частично, решены использованием метода AcroM-FISH [26]. Так как большинство SMCs возникает из акроцентрических хромосом (около 80%), авторы AcroM-FISH предлагают на первом этапе проверять, не происходит ли анализируемая SMCs из одной из акроцентрических хромосом, а если да, то определить:
а) из какой именно;
б) содержит ли SMCs материал эухроматиновых районов этой хромосомы.
В AcroM-FISH одновременно используется девять ДНК-проб: пэйнтинг пробы хромосом 13, 14, 15, 21 и 22; центромерные ДНК-пробы pZ21A (хромосомы 13/21), p14.1 (хромосомы 14/22) и pMC15 (хромосома 15); меченая рибосомальная ДНК (EcoR1 11.9 kb и 19.8 kb фрагменты рДНК человека). При тестировании данный метод позволил определить происхождение и присутствие эухроматинового материала в SMCs , для которых применение 24-х цветной FISH не дало положительных результатов. Авторы метода полагают, что отсутствие положительного результата при использовании AcroM-FISH является доказательством происхождения SMCs из неакроцентрических хромосом. В этом случае они предлагают использовать для дальнейших исследований стандартную М-FISH. Отметим, что в этом случае будет достаточно использовать 19 хромосомоспецифичных ДНК-проб, что позволит несколько увеличить чувствительность М-FISH.
Сравнительная геномная гибридизация (CGH), в отличие от М-FISH, позволяет определять не только принадлежность эухроматина SMCs , но также и его субхромосомную локализацию [32]. К сожалению, размер такого района SMCs должен быть не менее 10 Mb, а SMCs должна присутствовать не менее чем в 50% анализируемых клеток. Не может удовлетворить исследователей и точность определения границ эухроматинового района, входящего в состав SMCs . Можно надеяться, что проблемы, обусловленные размером SMCs и точностью определения границ ее эухроматиновых районов, могут быть решены привлечением в диагностику microarray CGH, но на сегодняшний день нам известно лишь о нескольких таких исследованиях [13]. Более серьезным осложнением использования CGH (включая microarray CGH) при анализе SMCs является клеточный мозаицизм. Практика использования CGH в диагностике раковых клеток показала, что присутствие в образце более 25% нормальных клеток уже требует выполнения дополнительных процедур по выделению материала, содержащего хромосомные аномалии. Следует также отметить, что SMCs , присутствие которой сочетается с делецией входящего в нее материала в исходной хромосоме, в принципе, не может быть идентифицирована этим методом.
Одним из эффективных подходов, используемых при анализе SMCs , является получение ДНК-библиотеки SMCs , которая затем используется для проведения CISS-гибридизации с метафазными хромосомами пациента и здорового донора. Пэйнтинг-проба, полученная на базе такой ДНК-библиотеки, окрашивает эухроматиновые районы SMCs и гомологичные им эухроматиновые районы нормальных хромосом. Так как обратный пэйнтинг может быть проведен на препаратах прометафазных или профазных хромосом здорового донора, то возможная точность описания состава маркерной хромосомы достигает уровня разрешения 850 бэндов на гаплоидный набор хромосом. Получение ДНК-библиотеки SMCs возможно путем ее изоляции методом микродиссекции [3; 35] или с помощью хромосомного сортинга с последующей амплификацией ДНК выделенной SMCs в полимеразной цепной реакции с частично вырожденным праймером (DOP-PCR). В принципе, получение амплификата ДНК SMCs возможно также созданием гибридов соматических клеток, содержащих SMCs как единственную хромосому человека, с последующей амплификацией ДНК гибридных клеток в inter-ALU-PCR [37]. Использование гибридов соматических клеток, помимо необходимости проведения огромной экспериментальной работы, имеет ряд серьезных недостатков. Одним из них является отсутствие гарантий идентичности исходной SMCs и SMCs , присутствующей в гибридных клетках. Второй проблемой является амплификация в inter-ALU-PCR ДНК только эухроматиновых районов SMCs , с предпочтительной амплификацией ДНК G-негативных сегментов.
Этих недостатков лишены микродиссекция метафазных хромосом и хромосомный сортинг. Различия этих методов заключаются в комплекте оборудования, необходимого для их проведения, во времени, необходимом для получения соответствующих ДНК-проб, и в образцах полученного от пациента материала, использование которого позволило бы приступить к проведению соответствующих исследований. Если для проведения микроманипуляционного сбора SMCs обычно достаточно остатков суспензии фиксированных клеток, подготовленной для рутинного цитогенетического анализа, то для проведения хромосомного сортинга требуется активно пролиферирующая культура. Получение такой культуры требует достаточно продолжительного времени, а при проведении пренатальной диагностики далеко не всякий материал может быть использован в этих целях. Это определило более широкое использование метода микродиссекции метафазных хромосом с последующей DOP-PCR для создания ДНК-проб SMCs .
Несмотря на достаточно высокую точность определения точки разрыва, имевшего место при формировании SMCs, которая может быть достигнута с помощью обратного пэйнтинга, она может оказаться недостаточной для определения окончательного диагноза и формулировки обоснованного прогноза при проведении пренатальной диагностики. В этих случаях для уточнения локализации точки разрыва может быть использована FISH с конкретными уникальными последовательностями ДНК интересующего района хромосомы. Например, для более точного описания inv dup(15) в качестве ДНК-проб могут быть использованы меченные клонированные последовательности ДНК: D15S541/S542, c512 (D15S543), 4-3R (D15S11), SNRPN, 3-21 (D15S10), и GABRB3 [21], для описания mar(22) - ДНК-пробы для локусов D22S9, D22S43, ATP6E, D22S427 и DGSCR [31].
Перспективным направлением в анализе SMCs представляется создание специальных чипов для выявления последовательностей из проксимальных районов хромосом, которые могут быть использованы для анализа микродиссекционных ДНК-библиотек SMCs. Такой подход позволит перейти на принципиально иной уровень разрешения в локализации точек разрыва. Исследования в этом направлении уже дали первые предварительные положительные результаты. В 2010-2011 годах следует ожидать первые публикации, в которых этот подход будет использован для практической диагностики.

Заключение
Анализ возможностей и проблем современной медицинской цитогенетики, а также тенденций ее развития наглядно демонстрирует не только непрерывно возрастающее значение новых технологий, базирующихся на разработках молекулярной биологии, но и необходимость выработки стратегии их оптимального использования. Переход от принципиальных возможностей проведения полноценной диагностики хромосомных аномалий к реальному и быстрому ее выполнению требует не только значительного улучшения материальной базы цитогенетических лабораторий, но и организации их эффективного взаимодействия.

Список литературы

Карамышева Т.В., Матвеева В.Г., Шорина А.Р., Рубцов Н.Б. Клинический и молекулярно-цитогенетический анализ редкого случая мозаицизма по частичной моносомии 3р и частичной трисомии 10q у человека // Генетика, 2001, 37, c. 811-816.
Рубцов Н.Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих. Федеральное Агентство по Образованию, Новосибирский государственный университет, Институт цитологии и генетики СО РАН. Новосибирск 2006, c. 1-147.
Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В., Матвеева В.Г., Саблина О.В., Сосницкая С.В., Андреенкова О.В., Гайнер Т.А., Дегтярева М.М. Обратная in situ гибридизация ДНК-зондов аномальных хромосом в диагностике хромосомных патологий // Генетика, 2001, 37, № 11, c. 15451552
Amor DJ, Choo KH. Neocentromeres: role in human disease, evolution, and centromere study // Am. J. Hum. Genet, 2002, 71, № 4. p. 695-714
Bain B.J. The role of cytogenetics in the assessment of haematological disorders. In: Human Cytogenetics. Volume II. Malignancy and acquired abnormalities. A practical approach. 1992. Ed by D.E.Rooney and Czepulkowski. Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. p. 121-154.
Blennow E, Bui TH, Kristoffersson U, Vujic M, Anneren G, Holmberg E, Nordenskjold M. Swedish survey on extra structurally abnormal chromosomes in 39 105 consecutive prenatal diagnoses: prevalence and characterization by fluorescence in situ hybridization // Prenat. Diagn. 1994, 14, № 11, p. 1019-1128
Cervantes A, Guevara-Yanez R, Lopez M, Monroy N, Aguinaga M, Valdez H, Sierra C, Canun S, Guizar J, Navarrete C, Zafra G, Salamanca F, Kofman-Alfaro S. PCR-PRINS-FISH analysis of structurally abnormal sex chromosomes in eight patients with Turner phenotype // Clin. Genet. 2001, 60, № 5, p. 385-392
Chudoba I., Plesch A., Loerch T., et al. High resolution multicolor-banding: a new technique for refined FISH analysis of human chromosmes. // Cytogenet Cell Genet. 1999, 84, p.156-160.
Chudoba I, Rubtsov N, Senger G, Junker K, Bleck C, Claussen U. Improved detection of chromosome 16 rearrangements in acute myeloid leukemias using 16p and 16q specific microdissection libraries. // ONCO REP 1996, 3, №5, p. 847-849.
Crolla JA, Howard P, Mitchell C, Long FL, Dennis NR. A molecular and FISH approach to determining karyotype and phenotype correlations in six patients with supernumerary marker(22) chromosomes // Am. J. Med. Genet. 1997, 72, № 4. p. 440447
Drumheller T., McGillivray B.C., Behrner D., MacLeod P., McFadden D.E., Roberson J., Venditti C., Chorney K., Chorney M., Smith D.I. Precise localisation of 3p25 breakpoints in four patients with the 3p-syndrome // J Med Genet 1996. 33, No 10, p. 842-847.
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] J, [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] W, [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] J[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ][ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] J, [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] A, [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] J. Disclosure of five breakpoints in a complex chromosome rearrangement by microdissection and FISH. J Med Genet 1996, 33, p. 562-566.
Fiegler H, Carr P, Douglas EJ, Burford DC, Hunt S, Smith J, Vetrie D, Gorman P, Tomlinson IP, Carter NP. DNA microarrays for comparative genomic hybridization based on DOP-PCR amplification of BAC and PAC clones // Genes Chromosomes Cancer. 2003, 36, № 4, p..361-374
Giardino D, Finelli P, Russo S, Gottardi G, Rodeschini O, Atza MG, Natacci F, Larizza L. Small familial supernumerary ring chromosome 2: FISH characterization and genotype-phenotype correlation // Am. J. Med. Genet. 2002, 111, № 3, p. 319-323
Graf MD, Schwartz S. Molecular approaches for delineating marker chromosomes // Methods Mol. Biol. 2002, 204, p. 211-218
Grimwade D, Walker H, Oliver F, Wheatley K, Harrison C, Harrison G, Rees J, Hann I, Stevens R, Burnett A, Goldstone A. The importance of diagnostic cytogenetics on outcome in AML: analysis of 1,612 patients entered into the MRC AML 10 trial. The Medical Research Council Adult and Children's Leukaemia Working Parties. // Blood. 1998, 92, №7, р. 2322-2333.
Haddad BR, Schrock E, Meck J, Cowan J, Young H, Ferguson-Smith MA, du Manoir S, Ried T. Identification of de novo chromosomal markers and derivatives by spectral karyotyping // Hum. Genet. 1998, 103, № 5. р. 619625
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]. Fiber-FISH: experiences and a refined protocol. // Genet Anal. 1996, 12, № 5-6, р. 179-84.
Heller A, Rubtsov N, Kytola S, Karamysheva TV, Sablina OV, Degtyareva MM, Starke H, Metzke H, Claussen U, Liehr T. Highly complex karyotypic changes in acute myelogenous leukemia: a case report. // Int J Oncol. 2003, 23, №1, р. 139-143.
Horvath JE, Bailey JA, Locke DP, Eichler EE. Lessons from the human genome: transitions between euchromatin and heterochromatin // Hum. Mol. Genet. 2001, 10, № 20, р.22152223
Huang B, Crolla JA, Christian SL, Wolf-Ledbetter ME, Macha ME, Papenhausen PN, Ledbetter DH. Refined molecular characterization of the breakpoints in small inv dup(15) chromosomes // Hum. Genet. 1997, 99, № 1, р.11-17
Huang B, Ning Y, Lamb AN, Sandlin CJ, Jamehdor M, Ried T, Bartley J. Identification of an unusual marker chromosome by spectral karyotyping // Am. J. Med. Genet. 1998, 80, №4, р. 368372
Ji Y, Eichler EE, Schwartz S, Nicholls RD. Structure of chromosomal duplicons and their role in mediating human genomic disorders // Genome Res. 2000, 10, № 5, р.597610
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]. Chromosome arm-specific multicolor FISH. [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] 2001, 30, № 1, р.105-109.
Knight L.A., Yong M.H., Tan M., Ng I.S. Del(3) (p25.3) without phenotypic effect // J Med Genet 1995, 32, No 12, р. 994-995.
Langer S, Fauth C, Rocchi M, Murken J, Speicher MR. AcroM fluorescent in situ hybridization analyses of marker chromosomes // Hum. Genet. 2001, 109, № 2, р. 152-158
Lasken RS, Egholm M. Whole genome amplification: abundant supplies of DNA from precious samples or clinical specimens // Trends Biotechnol. 2003, 21, № 12, р.531-535.
Liehr T. and Pellestor F. Molecular Cytogenetics: The Standard FISH and PRINS Procedure. In: Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) Application Guide, ed T. Liehr, 2009, Springer-Verlag Berlin Htidelberg, pp. 23-34
Lьdecke, H.J., G. Senger, U. Claussen & B. Horsthemke, 1989. Cloning defined regions of the human genome by microdissection of banded chromosomes and enzymatic amplification // Nature 338, р. 348–350.
Lьdecke HJ, Senger G, Claussen U, Horsthemke B. Construction and characterization of band-specific DNA libraries // Hum Genet. 1990, 84, № 6, р. 512-516.
Mears AJ, el-Shanti H, Murray JC, McDermid HE, Patil SR. Minute supernumerary ring chromosome 22 associated with cat eye syndrome: further delineation of the critical region // Am. J. Hum. Genet. 1995, 57, № 3, р.667-673
Micci F, Teixeira MR, Bjerkehagen B, Heim S. Characterization of supernumerary rings and giant marker chromosomes in well-differentiated lipomatous tumors by a combination of G-banding, CGH, M-FISH, and chromosome- and locus-specific FISH // Cytogenet. Genome Res. 2002, 97, № 1-2, р.13-19
Mueller S, O’Brien PC, Ferguson-Smith MA., Wienberg J. Cross-species colour segmentating: a novel tool in human karyotipe analysis. // Cytometry. 1998, 33. р. 445-452.
Mueller S, Rocchi M, Ferguson-Smith M., Wienberg J. Toward a multicolor chromosome bar code for the entire human karyotype by fluorescence in situ hybridization. // Hum Genet 1997, 100, р. 271-278 .
Muller-Navia J, Nebel A, Schleiermacher E. Complete and precise characterization of marker chromosomes by application of microdissection in prenatal diagnosis // Hum. Genet. 1995, 96, № 6. р. 661-667
Nietzel A, Rocchi M, Starke H, Heller A, Fiedler W, Wlodarska I, Loncarevic IF, Beensen V, Claussen U, Liehr T. A new multicolor-FISH approach for the characterization of marker chromosomes: centromere-specific multicolor-FISH (cenM-FISH) // Hum. Genet. 2001, 108, № 3, р.199-204
Raimondi E, Balzaretti M, Moralli D, Vagnarelli P, Tredici F, Bensi M, De Carli L.Gene targeting to the centromeric DNA of a human minichromosome // Hum. Gene Ther. 1996, 7, № 9, р. 11031109
Rubtsov N, Senger G, Kucera H, Neumann A, Kelbova K, Junker K, Beensen V, Сlaussen U. Interstitial deletion of chromosome 6q: report of a case and precise definition of the breakpoints by microdissection and reverse painting // Hum Genet. 1996, 97, p. 705-709
Shaffer LG, Lupski JR. Molecular mechanisms for constitutional chromosomal rearrangements in humans // Annu Rev. Genet. 2000, 34, р. 297329
Schroeck E., Manoir S., Veldman T. et al, Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes // Science 1996, 273, р. 494-497.
Schrцck E, Veldman T, Padilla-Nash H, Ning Y, Spurbeck J, Jalal S, Shaffer LG, Papenhausen P, Kozma C, Phelan MC, Kjeldsen E, Schonberg SA, O'Brien P, Biesecker L, du Manoir S, Ried T. Spectral karyotyping refines cytogenetic diagnostics of constitutional chromosomal abnormalities // Hum Genet. 1997, 101, № 3, р. 255-262
Senger G, Lьdecke HJ, Horsthemke B, Claussen U. Microdissection of banded human chromosomes // Hum Genet. 1990, 84, № 6, р. 507-511
Speicher M.R., Ballard S.G., Ward D.C. Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. // Nature Genet. 1996, 12, р. 368-375.
Telenius H, Carter NP, Bebb CE, Nordenskjцld M, Ponder BA, Tunnacliffe A. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. // Genomics. 1992, 13, № 3, р. 718-725.
Uhrig S, Schuffenhauer S, Fauth C, Wirtz A, Daumer-Haas C, Apacik C, Cohen M, Muller-Navia J, Cremer T, Murken J, Speicher MR. Multiplex-FISH for pre- and postnatal diagnostic applications // Am. J. Hum. Genet. 1999, 65, № 2 р. 448-462
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ].Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping // Nat Genet. 1997, 15, № 4, р. 406-410.
Vermeesch JR,· Duhamel H,·Petit P, Falzetti D,·Fryns J-P, Marynen P. Multiple small accessory marker chromosomes from different centromeric origin in a moderately mentally retarded male // Hum. Genet. 1999, 105, р. 611618
von Eggeling F, Spielvogel H. [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] // Cell Mol Biol. 1995, 41, № 5, р. 653-670.
Wandstrat AE, Schwartz S. Isolation and molecular analysis of inv dup(15) and construction of a physical map of a common breakpoint in order to elucidate their mechanism of formation // Chromosoma. 2000, 109, № 7, р. 498505
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]. Complete trisomy 22. // [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] 1993, 141, № 3, р. 211-213.
Yang F, O'Brien PC, Milne BS, Graphodatsky AS, Solanky N, Trifonov V, Rens W, Sargan D, Ferguson-Smith MA. [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] Genomics. 1999, 62, № 2, р. 189-202.
Yang F, Trifonov V, Bee ling Ng, Kosyakova N, Carter N. Generation of paint probes by Flow-sorted and Microdissected Chromosomes. In: Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) Application Guide, ed T. Liehr, 2009, Springer-Verlag Berlin Htidelberg, pp. 35-52
Yurov YB, Soloviev IV, Vorsanova SG, Marcais B, Roizes G, Lewis R. High resolution multicolor fluorescence in situ hybridization using cyanine and fluorescein dyes: rapid chromosome identification by directly fluorescently labeled alphoid DNA probes // Hum. Genet. 1996, 97, № 3, р. 390398

Подписи к рисункам.

Рисунок 1. Двухцветная FISH с хромосомоспецифическими ДНК-пробами (WCP5 –зеленый сигнал, WCP20 – красный сигнал). Хромосомы 2, der(2), 5 и der(5) указаны стрелками и подписаны.
Рисунок 2. Интенсивность свечения хромосом человека в проточной цитофотометрии при окраске Hoechst 33258 и хромомицином А3.
Рисунок 3. Принципиальная схема ПЦР с частично вырожденным праймером (DOP-PCR): а – денатурация матричной ДНК; б – отжиг частично вырожденного праймера в низкотемпературных циклах; в – построение первой цепи амплифицируемого фрагмента; г – отжиг праймера на первой цепи амплифицируемого фрагмента; д – синтез второй цепи амплифицируемого фрагмента, е-ж - синтез амплифицируемого фрагмента. Амплификация фрагмента ДНК, фланкированного DOP-праймером, проводиться в стандартной ПЦР.
Рисунок 4. Микродиссекция метафазных хромосом: а – GTG-дифференциально окрашенные хромосомы; б – выделение короткого плеча хромосомы 7; в - материал короткого плеча хромосомы 7 на игле, поднятой над препаратом; г – перенос материала короткого плеча хромосомы 7 в 40 нл каплю раствора в оттянутом носике пипетки; д – FISH микродиссекционной ДНК-пробы с метафазными хромосомами (слева: сигнал FISH в 7р – зеленый, окраска DAPI – красный; справа – только окраска DAPI)/
Рисунок 5. Визуализация ДНК-пробы, меченной биотином, с помощью стрептавидина, конъюгированного с флуорохромом.
Рисунок 6. LSI ДНК-пробы хромосомы 15 для детекции синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана.
Рисунок 7. LSI ДНК-пробы для хромосом 8 и 21 (а, б), организация районов хромосом 8 и 21, вовлекаемых в формирование транслокации t(8;21)(q22;q22), характерной для острого миелоидного лейкоза типа М2, и пробы, используемые для ее выявления (в). Детекция транслокации t(8;21)(q22;q22), характерной для острого миелоидного лейкоза М2 типа, с использованием ДНК-проб LSI AML1 и LSI ETO. Красные сигналы соответствуют району 8q22 (указаны стрелками), зеленые – району 21q22 (указаны головками стрелок). Желтые сигналы (совмещение красных и зеленых, указаны стрелками и головками стрелок) соответствуют районам транслокаций (г – норма, д – ядро с t(8;21)).
Рисунок 8. Детекция inv(16)(p13;q22)или t(16;16)(p13;q22) с использованием 16q специфичной ДНК-пробы у больных с острой миелоидной лейкемией. Черная стрелка указывает на нормальную хромосому 16, белая – на inv(16)(p13;q22)или t(16;16)(p13;q22).
Рисунок 9. Детекция inv(16)(p13;q22)или t(16;16)(p13;q22) с использованием LSI CBFB: а – схема района разрыва в 16q22; б – LSI ДНК-пробы для хромосомы 16; FISH c LSI CBFB (в – норма, г – ядро с inv(16)(p13;q22)или t(16;16)(p13;q22)).
Рисунок 10.Вариант комбинации флуорохромов для мечения цельнохромосомных ДНК-проб (24-цветная FISH).
Рисунок 11. Последовательная регистрация микроизображений метафазной пластинки после FISH с комбинаторномеченными пробами.
Рисунок 12. Окрашивание хромосомы 1 человека после RxFISH. Слева - схема гибридизации, справа – результат RxFISH.
Рисунок 13. Многоцветное окрашивание хромосомы 5 человека (слева), приведены результаты FISH семи районоспецифичных ДНК-проб; профили интенсивности пяти флуорохромов, использованных для их мечения; результаты перевода интенсивности сигналов в псевдоцвета; схема GTG-окрашивания хромосомы 5 человека.
Рисунок 14. Анализ аномальной хромосомы der(3)t(3;?). а – GTG-дифференциальная окраска хромосом (указан неидентифицируемый район в 3р); б – FISH микродиссекционной ДНК-пробы, полученной из аномальной хромосомы 3р+ с хромосомами здорового донора (белая стрелка указывает на район 10(q24.3qter), черная стрелка – на точку разрыва 3р); в - FISH WCP3 c метафазными хромосомами пациента (стрелки указывают на дополнительный район в хромосоме 3р+); г - FISH WCP10 c метафазными хромосомами пациента (белая стрелка указывает на район 10(q24.3qter) в хромосоме 3р+);, черные стрелки – на хромосомы 10); д – схема хромосомы der(3)t(3;10)(3p25;q24.3).
Рисунок 15. Анализ аномальной хромосомы der(6). а – FISH микродиссекционной ДНК-пробы, полученной из аномальной хромосомы der(6) с хромосомами здорового донора (стрелки указывают на район делеции. Красный сигнал – сигнал ДНК-пробы, зеленый сигнал – репликационный бэндинг, полученный введением BrdU); б – схема хромосомы del(6)(q23.127).
Рисунок 16. Анализ врожденных хромосомных аномалий при отсутствии препаратов метафазных хромосом пациента удовлетворительного качества. FISH микродиссекционных ДНК-проб, приготовленных из аномальных хромосом, с метафазными хромосомами здоровых доноров: а – FISH микродиссекционных ДНК-проб хромосом der(6)t(6;15) (зеленый сигнал) и der(15)t(6;15) (красный сигнал); б - FISH микродиссекционной ДНК-пробы хромосомы r(14) (зеленый сигнал).
Рисунок 17. 24-х цветная FISH, хромосомная диагностика острой миелолейкемии. M-FISH: а – раскладка хромосом по результатам M-FISH (интактная хромосома слева, дериват справа); б – классификатор псевдоцветов.
Рисунок 18. 24-х цветная FISH, хромосомная диагностика острой миелолейкемии. SKY: а – инвертированный DAPI бэндинг; б – классификация хромосом метафазной пластинки по результатам SKY; в – раскладка хромосом по результатам SKY (интактная хромосома слева, дериват справа); г – классификатор псевдоцветов.
Рисунок 19. Многоцветный бэндинг хромосомы der(1)t(1;5;8;20), хромосомная диагностика острой миелолейкемии: а - многоцветный бэндинг хромосом интактных хромосом; многоцветный бэндинг районов 1, 5, 8 и 20 хромосом в составе der(1)t(1;5;8;20). Район 5q11.1 не выявлен.
Рисунок 20. Определение состава хромосомы der(1), хромосомная диагностика острой миелолейкемии получением микродиссекционной ДНК-пробы аномальной хромосомы и FISH с метафазными хромосомами пациента (а, указана хромосома der(1)) и здорового донора (б, указаны районы, несущие сигнал после FISH c микродиссекционной ДНК-пробой аномальной хромосомы).
Рисунок 21. Обратная гибридизация in situ ДНК-пробы, полученной из SMC с неоцентромерой, дала интенсивный сигнал на SMC (указанf стрелкой), но не окрасила ни один районов нормальных хромосом пациента.








13PAGE 15


13PAGE 143915







Приложенные файлы

  • doc 234507
    Размер файла: 318 kB Загрузок: 4

Добавить комментарий