дезинтеграция микроорганизмов


МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РФ
ВЯТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Химический факультет Кафедра биотехнологии
ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ МИКРООГРАНИЗМОВ
Методические указания к лабораторной работе № 1
Дисц. "Общая биотехнология"
Киров 1998
удк
Составитель: инженер кафедры биотехнологии ВятГТУ А.А.Злобин
Рецензент: д.б.н., снс. В.Б.Калининский,
глав. специалист НИИМ МО РФ
Редактор А.Н.Корсаков
ЛР № 020519 от 20.06.97г.
Подписано в печать 3.02.98 Усл. печ. л. 0,9
Бумага типографская. Печать матричная.
Заказ № 37 Тираж 25 Бесплатно.
Текст напечатан с оригинал-макета, предоставленного автором
610 000, г. Киров, ул.Московская, 36. Оформление обложки, изготовление - ПРИП
© Вятский государственный технический университет, 1997
Права на данное издание принадлежат Вятскому государственному техническому университету
1 Общие положения
Завершающей стадией биотехнологического процесса является выделение целевого продукта. Эта стадия существенно различается в зависимости от того накапливается ли продукт в клетке (внутриклеточные метаболиты) или он выделяется в культуральную жидкость (внеклеточные метаболиты), или же продуктом является сама клеточная масса.
Возможны следующие принципиальные варианты выделения целевого продукта:
обезвоживание культуральной жидкости с получением сухого остатка в виде микробиологического концентрата (производство бактериальных удобрений, биоинсектицидных препаратов и др.);
фракционирование культуры клеток на биомассу и жидкую часть (фугат) с получением живой (хлебопекарные дрожжи,бактериальные удобрения и др.), ослабленной (вакцины) или инактивированной (кормовой белок) клеточной массы и продуктов различной степени очистки из фугата или биомассы.
Наиболее сложно выделение продукта, накапливающегося в клетках микроорганизмов. Для этого клетки необходимо отделить (флотация, фильтрация или центрифугирование) от культуральной жидкости, дезинтегрировать и очистить целевой продукт от массы компонентов разрушенных клеток (рис.1)
Под дезинтеграцией понимают необратимое нарушение анатомической целостности клеток. Практически это сводится к разрушению клеточной оболочки, прочность которой в ряде случаев сравнима с прочностью некоторых сортов стали.
Основным критерием качества дезинтеграции является максимальная сохранность структуры и функции компонентов клеток (органелл, биополимеров, физиологически активных веществ и др.)
Большое количество используемых клеточных компонентов обуславливает разнообразие целей и методов дезинтеграции клеток микроорганизмов. В настоящее время известно значительное количество методов дезинтеграции и число их постоянно растет, поскольку успех разрушения - чисто эмпирическая процедура, зависящая от выбора способа, применяемой аппаратуры, разрушаемой культуры, ее физиологического состояния и т.д. Дезинтеграция может быть одно- и многооперационной. Наиболее широко применяемые в промышленной и лабораторной практике методы дезинтеграции можно разделить на физические (механические и немеханические), химические и биологические (рис.2).

Рис.1 Основные этапы отделения и очистки биотехнологических продуктов.
Из сотен известных способов дезинтеграции большинство составляют физические:
разрушение клеток баллистическим методом с применением бус баллотини или кварцевого песка;
растирание клеток в дисковых мельницах;
разрушение с помощью вращающихся лопастей или вибраторов;
дробление замороженных в жидком азоте или сухом льду кле- ток;
экструдирование клеточной массы под высоким давлением (2-4.105 кПа) через узкую щель или отверстие;
газ декомпрессионное разрушение, основанное на создании в камере с разрушаемым материалом высокого давления (до 4.104 кПа) и быстрым сбросом его, приводящим к разрыву клеточных стенок;
разрушение клеток осмотическим шоком;
разрушение клеток замораживанием и последующим оттаиванием;
ультразвуковая дезинтеграция и т.д.

Рис.2. Методы дезинтеграции, применяемые для выделения клеточных компонентов
Среди физических способов дезинтеграции преобладают баллистические методы, хорошо управляемые и обладающие сравнительно хорошими технико-экономическими показателями. Серийный выпуск механических дезинтеграторов организован в ФРГ, Швейцарии, США и др. странах. Их производительность достигает 9-20 т/ч. Промышленное применение нашли гомогенизаторы высокого давления фирмы "Ман-тон-Гален" модели 15М-8ВА и КЗ производительностью 54 и 280 л/ч соответственно. Рабочая температура 5°С, давление 550 и 350 кг/см2. Дезинтеграция осуществляется продавливанием клеточной суспензии через специальные клапаны. Популярны мельницы КД5, КД15, КД50, КД200 (цифра указывает объем), дезинтеграторы "Нетц-LM20 и LM30 с микрошариками (производительность до 2000 л/ч). В нашей стране выпускается баллистический дезинтегратор ФУГ, который может быть использован для разрушения микроорганизмов, сверхтонкого измельчения, гомогенизации, эмульгирования и экстрагирования термочувствительных органических и биологических материалов из жидких сред. Принцип его работы основан на перемешивании клеток и антифрикционных полимерных мелющих тел, движущихся в мощном поле центробежной силы. Плотность мелющих тел подобрана равной плотности рабочей жидкости, что снижает энергозатраты на перемешивание.
При использовании некоторых из физических способов, основанных на воздействии ультразвуковых колебаний, экструзии, декомпрессии, созданы установки, которые применяются для дезинтеграции различных еидов микроорганизмов. Так, для жидкостной экструзионной дезинтеграции суспензии клеток микроорганизмов применяются дезинтеграторы ДКМ-3 и ДКМ-4. Принцип их работы основан на продавливании суспензии микроорганизмов через микрощель из области высокого давления (до 3.105 кПа) в область нормального атмосферного давления. Все более широкое применение в процессах выделения внутриклеточных соединений находит и метод ультразвукового разрушения микробных клеток.
Химические способы дезинтеграции основаны на деструкции упорядоченных структур клеточной оболочки микроорганизмов. В результате значительного увеличения проницаемости оболочки биополимеры с большой молекулярной массой выводятся из клетки. Наиболее известные химические способы разрушения: обработка суспензии клеток
кислотами, щелочами, мочевиной, глицерином, аммиаком, перекисью водорода, глицином, некоторыми детергентами (поверхностно-активными веществами) и др.
Механизм действия детергентов основан на адсорбции их молекул на поверхности клеток с последующим проникновением внутрь пористой клеточной стенки и взаимодействии с липопротеидными комплексами, включая реакции с гидрофобными участками белков и ориентированных липидов, приводящим к дезорганизации мембран. К числу распространенных детергентов, которые используются с целью повышения проницаемости бактериальных клеток, относятся твины (сорбитали)-сорбитан-бис-(полиоксизтилен)-моноалкаонаты-твин 40, 60, 80 и т.д. Применение поверхностно-активных веществ в ряде случаев нежелательно, учитывая последующие технологические процессы, связанные с очисткой.
К разрушению клеточной оболочки ведет также обработка клеток толуолом или бутанолом, что находит промышленное применение при получении дрожжевого автолизата и ряда ферментов (инвертаз, пенициллинамидазы и др.).
Среди биологических способов дезинтеграции клеток наибольшее распространение получили энзиматические методы. Они основаны на применении литических ферментов, разрушающих клеточную оболочку: лизоцима, выделяемого из белка куриных яиц и разрушающего, главным образом, оболочки клеток грамотрицательных бактерий в присутсвии этилендиаминтетрауксусной кислоты; ферментного комплекса (зимолиаза), содержащегося в желудочном соке улитки Helix pomatia или продуцируемого некоторыми видами актиномицетов и грибов, лизирующего оболочки эукариотических клеток; лизосубтилина, лизирующего клетки дрожжей, плесневых грибов, грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также собственного ферментного комплекса клеток для их автолиза при лимитированном по определенному субстрату росте и т.д.
Кроме энзиматических методов для дезинтеграции клеток бактерий, применяют вещества, ингибирующие синтез клеточной оболочки (антибиотики). В часности, принцип действия некоторых антибиотиков (пенциллинов, цефалоспоринов) основан на том, что они мешают образованию поперечных связей между короткими цепями пептидогли-канов оболочки, в результате чего она теряет свою прочность. Эффективный лизис клеток вызывают также антибиотики полимиксины,
бацитрацины, тироцидины, новобиоцин, нистатин и другие.
Использование для лизиса клеточной оболочки метода заражения клеток бактериофагами сопряжено с риском неконтролируемого распространения фага и поэтому не получило применения в промышленных установках.
Выбор метода дезинтеграции зависит от свойств конкретной культуры и необходимого продукта, метода дальнейшей обработки дезинтегратов, цели дезинтеграции (аналитическая, производство) и ряда других факторов.
Наибольшее индустриальное значение имеют физические и химические способы разрушения. Физические методы более экономичны, их можно осуществлять в непрерывном режиме с высокой степенью автоматизации процесса. Кроме того, они не требуют использования дорогостоящих и дефицитных реактивов и ферментных препаратов. В то же время этим способам дезинтеграции клеток присуща определенная неизбирательность - обработка может отрицательно влиять на качество получаемого продукта. Однако при тонкой регулировке условий дезинтеграции некоторые из физических методов позволяют целенаправленно выделить какую-либо одну фракцию внутриклеточного содержимого. В частности, для получения пищевого белка и внутриклеточных ферментов наиболее часто применяют баллистические и экструзионные методы дезинтеграции клеток. Для аналитических целей весьма часто применяют экструзионные дезинтеграторы с замораживанием продукта.
Химические способы дезинтеграции клеток микроорганизмов используют в основном для выделения суммарных белков пищевого назначения. Распространение их в биотехнологических процессах сдерживается нежелательными эффектами, возникающими при химической дезинтеграции: нарушение целостности клеточных структур, инактивации ферментов и т.д. Так, например, при обработке суспензии клеток микроорганизмов щелочью в определенных условиях образуется лизин-аланин, или лантионин, из-за чего снижаются количество доступного лизина и питательная ценность получаемого белка.
При выделении внутриклеточных компонентов микрорганизмов биологическими способами, разрушение клеточной оболочки осуществляется, безусловно, наиболее мягким образом (например, расщепление клеток при помощи литических ферментов). Поэтому энзиматические методы дезинтеграции широко применяют в научных исследованиях
для выделения субклеточных структур - органелл, мембран, газовых везикул и т.д., которые могут разрушаться при дезинтеграции клеток механическим или химическим способами.
Развитие ферментативной дезинтеграции в биотехнологических процессах сдерживается сравнительно высокой стоимостью ферментных препаратов и отсутствием высокоочищенных литических ферментов. Литические ферментные препараты обычно малостабильны и нестандартны. Исключение составляет автолиз клеток под действием внутриклеточных литических ферментов при получении пищевого белкового экстракта. Один из путей преодоления этих трудностей - применение иммобилизованных ферментов. Так, например, с помощью иммобилизованных на коллагеновых пленках лизирующих ферментов Streptomyces sp. можно разрушить клеточные стенки высушенных и интактных живых, кормовых, хлебопекарных и пивных дрожжей.
Степень дезинтеграции клеток контролируют:
по содержанию в гомогенате растворенного белка;
подсчетом количества неразрушенных клеток путем микроскопирования;
по изменению светорассеяния суспензии клеток и дезинтеграта.
За дезинтеграцией клеток следует этап отделения фрагментов оболочек разрушенных клеток и неразрушенных клеток. При этом используют те же методы, что и при сепарации культуры клеток: центрифугирование или фильтрацию. Однако, сообразуясь с размерами субклеточных частиц, применяют более высокооборотные центрифуги и фильтры с меньшим диаметром пор (часто мембранные), чем при сепарации клеток. В большинстве биотехнологических процессов клеточные оболочки отбрасывают, как балласт, но возможно и промышленное получение компонентов клеточных оболочек как целевого продукта. Осветленный раствор обрабатывают так же, как культуральную жидкость при выделении из нее внеклеточных метаболитов.
2 Содержание лабораторного занятия
Цель занятия: ознакомление с технологией выделения внутриклеточных компонентов клеток микроорганизмов;
- овладение лабораторными навыками дезинтеграции микроорганизмов физическими (механическими) и химическими способами напримере разрушения клеток бактерий, дрожжей и грибов.
В фарфоровую ступку помещают 3 г биомассы, взвешенной с точностью 0.01 г, добавляют 6 г кварцевого песка и растирают в течение 10 мин.
В полученную гомогенную смесь добавляют 10 см3 1/15 М расвора фосфатного буфера (рН-7,0), перемешивают и переносят в центрифужные пробирки. Смывают стенки ступки и пестик 10 см3 фосфатного буфера и сливают раствор в те же пробирки.
Центрифугирование проводят в течение 15 мин при 1200 g для дрожжевой и грибной биомассы и 30 мин при 6000 g - для бактериальной.
Супернатант переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3. Осадок объединяют, добавляют к нему 15 см3 фосфатного буфера и центрифугируют при тех же условиях.
Затем жидкость из центрифужной пробирки сливают в колбу с супернатантом. Доводят содержимое мерной колбы до метки фосфатным буфером и, после перемешивания, определяют содержание белка в растворе.
2.2.2 Разрушение биомассы в жидкой фазе
Для разрушения биомассы в жидкой фазе используют лабораторный гомогенизатор MPW-302. В металлическом стакане прибора объемом 200 см3 взвешивают 3 г биомассы с точностью 0.01 г, добавляют с помощью пипетки 6 см3 1/15 М фосфатного буферного раствора. Стакан закрепляют в кольце прибора и погружают его в водяную баню со льдом. Разрушение проводят при скорости вращения насадки -5000 об/мин в течение 5 минут. Гомогенат освобождают от неразрушенных клеток и крупных клеточных частиц центрифугированием по выше изложенному режиму. Общий объем супернатанта доводят в мерной колбе фосфатным буфером до 50 см3.
2.3 Определение содержания растворимого белка в дезинтеграте
Для сравнения эффективности использованных методов дезинтеграции клеток микроорганизмов определяют количество растворимого белка в гидролизате и супернатанте по методу Лоури. Этот метод основан на измерении интенсивности окраски раствора, в котором осущетвляется по меньшей мере две цветные реакции на белок:
- биуретовая реакция на пептидные, т.е. -C0-NH- связи, с образованием окрашенного чаще всего в фиолетовый цвет комплексного соединения меди с анализируемыми пептидными группами (интенсивность окраски зависит от концентрации белка в растворе)
Материалы и оборудование
Весы лабораторные 4-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 500 г ВЛКТ-500М; весы лабораторные 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г ВЛР-200; водяная баня EL-20; гомогенизатор MPW-302; колориметр фотоэлектрический концентрационный КФК-2; центрифуга лабораторная медицинская ОПн-8; воздушный холодильник с пробкой; колба коническая. Кн-2-100; колба мерная 2-1 (2)-50; пипетки 2-1 (2)-5(10); пробирки химические П2; пробирки для центрифугирования; фарфоровая ступка N 4, 5; цилиндр 2(3)-100; кварцевый песок; казеин; натрия гидроксид, 0,1 и 0,25 Н раствор; реактив А - 2% раствор карбоната натрия в 0,1 Н растворе гидроксида натрия; реактив В - 0,5% раствор сульфата меди (кристаллогидрат) в 1% растворе виннокислого натрия или калия; реактив С - готовят перед определением, смешивая 50 см3 реактива А с 1 см3 реактива В; реактив Фолина; фосфатный буфер (рН-7,0); дистиллированная вода; калибровочный график.
Ход работы
При выполнении данной работы студентам предоставляют образцы свежесобранной бактериальной, дрожжевой и грибной биомассы. В каждом варианте работы проводят разрушение одного из видов биомассы химическим и физическим способами, определяют количество выделившегося белка и оценивают эффективность примененных методов дезинтеграции.
2.1 Разрушение клеток химическим методом
В конической колбе объемом 100 см3 взвешивают 0,5 г биомассы с точностью 0.001 г, добавляют 40 см3 0,25 Н раствора гидроксида натрия. Закрывают колбу пробкой с воздушным холодильником и помещают ее на водяную баню.
Гидролиз проводят при температуре 90°С в течение 1 часа. Затем колбу охлаждают под струей холодной воды и переносят ее содержимое в мерную колбу объемом 50 см3 .
С помощью дистиллированной воды доводят объем гидролизата до метки, перемешивают и используют для определения содержания в нем растворимого белка.
2.2 Разрушение биомассы физическим (механическим) методом
2.2.1 Разрушение биомассы в твердой фазе
В фарфоровую ступку помещают 3 г биомассы, взвешенной с точностью 0.01 г, добавляют 6 г кварцевого песка и растирают в течение 10 мин.
В полученную гомогенную смесь добавляют 10 см3 1/15 М раствора фосфатного буфера (рН-7,0), перемешивают и переносят в центрифужные пробирки. Смывают стенки ступки и пестик 10 см3 фосфатного буфера и сливают раствор в те же пробирки.
Центрифугирование проводят в течение 15 мин при 1200 g для дрожжевой и грибной биомассы и 30 мин при 6000 g - для бактериальной.
Супернатант переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3. Осадок объединяют, добавляют к нему 15 см3 фосфатного буфера и центрифугируют при тех же условиях.
Затем жидкость из центрифужной пробирки сливают в колбу с супернатантом. Доводят содержимое мерной колбы до метки фосфатным буфером и, после перемешивания, определяют содержание белка в растворе.
2.2.2 Разрушение биомассы в жидкой фазе
Для разрушения биомассы в жидкой фазе используют лабораторный гомогенизатор MPW-302. В металлическом стакане прибора объемом 200 см3 взвешивают 3 г биомассы с точностью 0.01 г, добавляют с помощью пипетки 6 см3 1/15 М фосфатного буферного раствора. Стакан закрепляют в кольце прибора и погружают его в водяную баню со льдом. Разрушение проводят при скорости вращения насадки -5000 об/мин в течение 5 минут. Гомогенат освобождают от неразрушенных клеток и крупных клеточных частиц центрифугированием по выше изложенному режиму. Общий объем супернатанта доводят в мерной колбе фосфатным буфером до 50 см3 .
2.3 Определение содержания растворимого белка в дезинтеграте
Для сравнения эффективности использованных методов дезинтеграции клеток микроорганизмов определяют количество растворимого белка в гидролизате и супернатанте по методу Лоури. Этот метод основан на измерении интенсивности окраски раствора, в котором осущетвляется по меньшей мере две цветные реакции на белок:
- биуретовая реакция на пептидные, т.е. -C0-NH- связи, с образованием окрашенного чаще всего в фиолетовый цвет комплексного соединения меди с анализируемыми пептидными группами (интенсивность окраски зависит от концентрации белка в растворе)

- реакция Фалина с тирозиновым и цистеиновым радикалами белковой молекулы.
Последняя состоит в восстановлении смеси фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот (реактив Фолина) с образованием комплексного соединения синего цвета. Полагают, что в восстановлении принимают участие комплексные соединения меди, возникшие при взаимодействии белка со щелочным раствором медного купороса (биурет). Вторая из упомянутых реакций не очень специфична, но весьма чувствительна. Поэтому метод Лоури позволяет вести определение белков в сильно разбавленных растворах, содержащих всего несколько микрограммов белка, и, как правило, применяется для их определения в элюатах с колонок при фракционировании на ионообменных смолах и сефадексах.
В пробирку вносят 0,4 см3 исследуемого раствора (гидролизат, супернатант или их разведения), добавляют 4 см3 реактива С, содержимое перемешивают и оставляют на 10 мин. Затем добавляют 0,4 см3 реактива Фолина и, перемешав, помещают пробирку в затемненное место на 30 мин. для развития окраски. При этом желтая окраска раствора постепенно переходит в синюю.
Параллельно проводят аналогичную реакцию на реактивы, используя вместо исследуемого раствора дистиллированную воду. Для этого в контрольную пробирку вносят 0,4 см3 дистиллированной воды, 4 см3 реактива С и 0,4 см3 реактива Фолина.
Оптическую плотность раствора измеряют на фотоэлектрокслориметре при длине волны 750 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют контрольный раствор.
Содержание белка в испытуемой пробе устанавливают по калибровочному графику, построенному заранее по раствору какого-либо чистого белка точно известной концентрации. Лучше всего использо-
вать раствор того белка или смеси белков, определение которых ведут по методу Лоури, т.к. как и все другие основанные на цветных реакциях методы, он дает абсолютные данные, если калибровочный график построен по тому же белку, определение которого ведут при посредстве цветной реакции.
Для построения калибровочного графика белок растворяют в 0,1Н растворе гидроксида натрия и путем разведения исходного концентрированного раствора (400 мг на 0,4 см3) готовят серию растворов, содержащих от 20 до 400 мкг белка на 1 см3 раствора. В качестве стандартных белков используют кристаллический яичный или сывороточный альбумин, казеин и т.п. С каждым из указанных растворов проводят не менее трех раз реакцию Лоури, применяя те же количества реагентов, что и для исследуемых растворов. По полученным данным строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрации белков в растворе, а на оси ординат - их оптическую плотность.
2.4 Обработка результатов
Содержание белка (мкг/см3) в растворе рассчитывают по формуле (1):

где 2,5 - коэффициент пересчета объема исследуемого раствора на 1 см3 ;
а - найденное по калибровочному графику содержание белка в 0,4 см3 исследуемого раствора, мкг;
n - разведение исследуемого раствора. Эффективность использованных способов дезинтеграции оценивают по количеству белка, перешедшего в гидролизат или супернатант при разрушении 1 г сухой биомассы и вычисляют по формуле (2):

где: q - содержание белка в исследуемом растворе, мкг/см3; V - объем гидролизата или супернанта, см3 ; m - масса навески биомассы, г.
Полученные данные заносят в таблицу.
Эффективность методов дезинтеграции.
№ п/п
Разрушаемая культура
Метод дезинтеграции
Масса разрушенного материала, г
Содержание белка в растворе, мгк/см3
Эффективность метода разрушения, %









3 Техника безопасности
Лабораторное занятие проводят при строгом соблюдении правил безопасности при работе в химической и микробиологической лабораториях.
4 Вопросы по теме занятия
Для каких целей проводят дезинтеграцию клеток микроорганизмов?
Какие основные методы дезинтеграции клеток вы знаете?
Как осуществляется контроль степени дезинтеграции?
В чем сущность количественного определения белка по методу Лоури?
Какой из применяемых в работе методов разрушения клеток более эффективен и почему?
Каковы основные достоинства и недостатки использованных в работе методов дезинтеграции?
5 Литература по теме занятия
Биотехнология: Учебное пособие для вузов: в 8 кн. Под ред. Н.С.Егорова и др.- М: Высш. шк., 1987.
У. Е. Виестур и др. Биотехнология. Биологические агенты, технология, аппаратура.- Рига: Зинатне, 1987.
Л.И.Воробьева. Промышленная микробиология.- М.: Изд-во МГУ, 1989.
И.М.Грачева и др. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия.- М.: Колос, 1992.
Итоги науки и техники. Микробиология, т.8. Дезинтеграция микроорганизмов.- М., 1978.
Ю.Б.Филиппович и др. Практикум по общей биохимии.- М.: Просвещение, 1975.
Методические указания к лабораторным работам по курсу Биохимические основы микробиологических производств. Под ред. А.Д. Голобова - М.: Изд-во МХТИ им. Д.И.Менделеева, 1981.
Содержание
Общие положения 3
Содержание лабораторного занятия 9
Техника безопасности 14
Вопросы по теме занятия 14
Литература по теме занятия 14-15

15

Приложенные файлы

  • doc 5831015
    Размер файла: 166 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий