МІКРОБІОЛОГІЯ — ЛАБ. РОБ.ч 1


МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ
ОДЕСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ ПОЛІТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ХІМІКО-ТЕХНОЛОГІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра органічних і фармацевтичних технологій






МІКРОБІОЛОГІЯ

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ
ДО ЛАБОРАТОРНИХ РОБІТ

Частина 1

































Одеса-2010

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ
ОДЕСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ ПОЛІТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ХІМІКО-ТЕХНОЛОГІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра органічних і фармацевтичних технологій







МІКРОБІОЛОГІЯ

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ
ДО ЛАБОРАТОРНИХ РОБІТ

Частина 1

для студентів спеціальності
7.110204 – Технологія фармацевтичних препаратів









Затверджено
на засіданні кафедри
органічних і фармацевтичних
технологій
Протокол № від














Одеса-2010


Методичні вказівки до лабораторних робіт з дисципліни «Мікробіологія» частина 1 для студентів спеціальності 7.110204– Технологія фармацевтичних препаратів/ Укл.: О.О. Протункевич, К.О. Присяжнюк, І.П. Цимбал. ОНПУ - 22 с.


Укладачі: О.О.Протункевич , доц. ОФТ
І.П. Цимбал, доц. ОФТ
К.О. Присяжнюк, старш. викл. ОФТ











































Зміст

13 TOC \o "1-1" \h \z 1413 LINK \l "_Toc252394220" 14Лабораторна робота № 1. Імерсійна мікроскопія. Техніка мікроскопіювання 13 PAGEREF _Toc252394220 \h 1451515
13 LINK \l "_Toc252394221" 14Лабораторна робота № 2. Мікроскопіювання живих мікроорганізмів. Приготування препаратів «розчавлена крапля» та «висяча крапля» 13 PAGEREF _Toc252394221 \h 1471515
13 LINK \l "_Toc252394222" 14Лабораторна робота № 3. Приготування мазка і фіксація мазку-препарату. Прості методи фарбування мікроорганізмів 13 PAGEREF _Toc252394222 \h 1481515
13 LINK \l "_Toc252394223" 14Лабораторна робота № 4. Складні (диференційні) методи фарбування мікроорганізмів 13 PAGEREF _Toc252394223 \h 1491515
13 LINK \l "_Toc252394224" 14Лабораторна робота № 5. Культивування бактерій. Штучні поживні середовища. 13 PAGEREF _Toc252394224 \h 14111515
13 LINK \l "_Toc252394225" 14Лабораторна робота № 6. Колонії мікроорганізмів. Вивчення їх культуральних властивостей 13 PAGEREF _Toc252394225 \h 14121515
13 LINK \l "_Toc252394226" 14Лабораторна робота № 7. Стерилізація. Методи стерилізації 13 PAGEREF _Toc252394226 \h 14131515
13 LINK \l "_Toc252394227" 14Лабораторна робота № 8. Мікробіологічне дослідження повітря 13 PAGEREF _Toc252394227 \h 14151515
13 LINK \l "_Toc252394228" 14Лабораторна робота № 9. Санітарно-мікробіологічне дослідження води. Визначення мікробного числа води 13 PAGEREF _Toc252394228 \h 14161515
15
































Вступ

Методичні вказівки до виконання лабораторних робіт з дисципліни «Мікробіологія» (частина 1) розроблено для студентів спеціальності «Технологія фармацевтичних препаратів».
Методичні вказівки складаються з 9 лабораторних робіт згідно робочої навчальної програми. Розглянуті теми, які присвячені імерсійної мікроскопії, методам приготування та фіксації мікробіологічних мазків; простим та складним методам фарбування препаратів; методам посіву мікроорганізмів (м/о) на різні поживні середовища; вивченню тинкторіальних, культуральних та морфологічних ознак мікроорганізмів, які необхідні для проведення їх ідентифікації; методам стерилізації; визначення мікробних числових показників повітря та води.

Лабораторна робота № 1. Імерсійна мікроскопія. Техніка мікроскопіювання

1. Теоретична частина

Будова світлового мікроскопу

Мікроскоп – оптичний пристрій для вивчення малих об’єктів, які недоступні до бачення неозброєним оком. Конструктивно світловий мікроскоп складається з трьох частин: оптичної, механічної та освітлювальної.

Механічна частина мікроскопу

тубус, служить для встановлення об
·єктиву та окуляру однієї оптичної осі та певний відстані один від одного
окуляр, знаходиться у верхній частині тубусу
револьверний механізм з об
·єктивами кріпиться до нижньої частини тубусу та складається з двох дисків. До нижнього диску угвинчені об
·єктиви.
тубусотримач
предметний столик на який поміщують дослідний препарат. В центрі столик є отвір для проходження світлових промінів, які висвітлюють препарат.
макрогвинт - це парний гвинт для макронастройки.
мікрогвинт - для мікронастройки мікроскопу, щоб отримати зображення дослідного препарату. При одному повному обороті зміщення складає 0,1 мм. При наводці мікроскопу дозволяється робити мікрогвинтом обертання лише на 1,5-2,0 обороту в один або другий бік!

Оптична система мікроскопу

До оптичної частини входить: оптична збільшувальна та освітлювальна частини. Оптична збільшувальна частина складається з об
·єктиву та окуляру.
Об
·єктив - є основною та найважливішою частиною, яка складається з склеєних канадським бальзамом лінз, які поміщені у металічний корпус. Та лінза, яка звернена до препарату, називається фронтальною. Маються також так звані корекційні лінзи, які дають більше збільшення та усувають аберації. Аберації бувають. Існують два типі аберації: сферична та хроматична.
За способом застосування об
·єктиви поділяються на сухі (сухо-повітряні) та імерсійні. При сухий системі між препаратом та об
·єктивом знаходиться повітря, а при імерсійної – олія, яка наноситься на препарат перед мікроскопіюванням. «Імерсія» - це «занурення». Імерсійну систему застосовують для об
·єктивів, які збільшують у 90 разів.
При імерсійної системі відхилення променя при виході з предметного скла є можливість цього уникнути, так як коефіцієнт заломлення олії 1,515, якій майже дорівнює коефіцієнту заломлення скла. Таким чином, при імерсійної системі до об
·єктиву мікроскопу попадає більша кількість світлових променів, а ступень освітлення – збільшується.
Оптичні характеристики об
·єктивів:
- ступень збільшення;
- фокусна відстань;
- числова апертура;
- роздільна здатність.
Ступень збільшення – вказана на корпусі об
·єктиву. Для імерсійної мікроскопії використовується об
·єктив з 90- кратним збільшенням.
Фокусна відстань – має розміри від 1,3 до 60 мм. Чим більше збільшення лінзи, тим більше її кривизна і менше фокусна відстань.
Роздільна здатність - це здатність відображати найдрібніші деталі досліджуваного матеріалу.
Числова апертура – це множення показника заломлення середовища (повітря – 1,000; олія – 1,515) на синус кута, якій утворюється крайовими променями, яків ходять в об
·єктив через фронтальну лінзу. Числова апертура вказана на корпусі об
·єктиву.
Окуляр – це пристрій, якій складається з двох лінз. Верхня лінза для ока, а нижня – збиральна. Для імерсійної мікроскопії використовується окуляри збільшенням 15х разів.
Загальне збільшення мікроскопу = 90 х 15 = 1035 разів.
Освітлювальна система мікроскопу знаходиться під предметним столиком. Складається з дзеркала, ірис-діафрагми та конденсора. Дзеркало направляє промені світла від джерела світла на препарат. Дзеркало з одного боку пласке (денне світло), з другого – увігнуте (використання штучного освітлення). За допомогою цього регулюється ступень освітленості препарату.
Ірис-діафрагма складається з набора тонких сегментних пластинок, які можливо здвигати та розсовувати за допомогою важелю, що змінює розміри отвору в центрі діафрагми та ступінь освітлення.
Конденсор складається з двох лінз: з верхньої – плоско-опуклої та подвійно-опуклої. Світлові промені проходять через конденсор та збираються в пучок (конденсуються). При роботі з офарбованими препаратами конденсор повинний бути розташований у найбільш верхнє положення, а ірис-діафрагма повинна бути повністю відкрита. При мікроскопіюванні нефарбованих препаратів конденсор опускають.

Техніка мікроскопіювання

1. Розмістити мікроскоп для зручної роботи.
2. Провірити ірис-діафрагму.
3. Перевести конденсор до верхнього положення.
4. Встановити дзеркало. Положення повинно бути таким, щоб на верхньої лінзі конденсора з
·явилось світло.
5. Обертаючи револьвер встановити об
·єктив на 8х. Освітленість провіряють за допомогою цього об
·єктива.
6. Помістити на столик мікроскопу дослідний препарат. При мікроскопуванні офарблених фіксованих препаратів завжди використовують імерсійну систему. На препарат нанести краплю олії.
7. Обертаючи макрогвинт вести спостереження з боку, опускаючи об
·єктив до дотикання його з олією.
8. Дивлячись в окуляр провести наводку.
9. Вивчити препарат.
10. Підняти об
·єктив догори. Витерти олію з фронтальної лінзи. Встановити револьверний механізм на заглушку та опустити додолу.

2. Експериментальна частина

Матеріал та обладнання: світловий мікроскоп, імерсійна олія, готовий дослідний мікропрепарат.

2.1. Зарисувати мікроскоп з імерсійним об
·єктивом. Вивчити будову мікроскопу.
2.2. Провести пробне мікроскопування готового дослідного мікропрепарату.

3.Контрольні питання

3.1. Поняття про імерсійну мікроскопію.
3.2. Типи аберацій.
3.3. Оптичні характеристики об
·єктивів.
3.4. Правила мікроскопування.

Лабораторна робота № 2. Мікроскопіювання живих мікроорганізмів. Приготування препаратів «розчавлена крапля» та «висяча крапля»

1. Теоретична частина

Для вивчення м/о під мікроскопом необхідно приготувати препарат. В залежності від того які м/о вивчають з живі чи мертві готують різні препарати. Для вивчення рухливості, розмноження, дії різних факторів необхідно вести нагляд над живими мікроорганізмами. Для цього використовуються препарати «розчавлена крапля» та «висяча крапля» для вивчення морфологічних особливостей – форми, розміри і т.д. використовуються мертві м/о – приготовляють фіксовані препарати –мазки. Для приготування препаратів використовують предметні та покривні стекла. Головні вимоги – стекла повинні бути абсолютно чистими, прозорими та добре знежиреними.

Приготування препарату «розчавлена крапля»

До центру предметного скла нанести бактеріальною петлею крапля водопровідної води (дистильовану воду не використовують). Петлю прожарити в полум’ї спиртівки, охолоджують та з її допомогою набрати дослідну культуру м/о (не повне вушко петельки). Дослідну культуру внести в краплі води на предметному склі та рівномірно розмішують круговими рухами до отримання однорідної мутної суспензії (суспензія не повинна бути густою). Якщо дослідна культура знаходиться в рідкому поживному середовищі, то води не потрібна. До нанесеної краплі піднести покривне скло приблизно під кутом 45о та з цього допомогою трохи простигають по поверхні предметного скла та щільно, щоб крапля рівномірно розташовувалася та щільно прижати покривне скло до предметного. Надлишок виступаючої вологи видаляють фільтрувальним папером. Між предметним та покривним склом не повинно бути бульбашок повітря, так як вони перешкоджають мікроскопуванню. Мікроскопування ведуть за допомогою сухо-повітряному об
·єктиву при трохи затемненому полі зору, конденсор трохи опускають.

Приготування препарату «висяча крапля»

До центру покривного скла нанести бактеріальною петлею краплю водопровідної води (дистильо
·
·
·
·
·f
·
·
·
·
·
·
·
·
·™
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·М
·
·
·
·
·
·
·
·
·я
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·™
·
·
·
·
·
·
· м/о звисала по центру лунки та не чіпала її дно. Мікроскопування ведуть за допомогою сухо-повітряного об
·єктиву при трохи затемненому полі зору, конденсор трохи опускають.

2. Експериментальна частина

Матеріал та обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, культура м/о, етиловий спирт, світловий мікроскоп, штативи, предметні скла, покривні скла, предметне скло з лункою.
2.1. Приготувати препарат для дослідження культури м/о – «розчавлена» крапля. Мікроскопіювати. Нарисувати.
2.2. Приготувати препарат для дослідження м/о – «висяча» крапля.
Мікроскопіювати. Зарисувати.

3. Контрольні питання

3.1.Умови при мікроскопіюванні живих та мертвих м/о.
3.2.Умови та правила приготування препарату «розчавлена крапля».
3.3.Умови та правила приготування препарату «висяча крапля».

Лабораторна робота № 3. Приготування мазка і фіксація мазку-препарату. Прості методи фарбування мікроорганізмів

1.Теоретична частина

Забір досліджуваного матеріалу

Бактеріологічну петлю беруть правою рукою, пропалюють в полум'ї спиртівки. Петлю необхіднотримати як ложку.
З рідких культур краплю матеріалу нанести на предметне скло за допомогою бактеріальної петлі і рівномірно розподілити по центру скла. Шар препарату повинен бути тонким і мати круглу форму (d = 1-2 см2 ).
З культури мікроорганізмів на твердому середовищі за допомогою петлі зробити забір мікробної маси і розмішати з краплею води на предметному склі. Шар препарату повинен бути тонким і мати круглу форму (d= 1-2 см2).
Залишки культури на петлі спалити в полум'ї спиртівки.
Мазок висушити, тримаючи препарат мазком вгору високо (20-25 см) над полум'ям спиртівки або на повітрі при кімнатній температурі.

Фіксаця мазка

Після повного висихання мазки фіксують, чим досягається умертвіння мікробів і міцне прикріплення їх до скла. Фіксація покращує фарбування мікробів. Найпростіший спосіб - фіксація жаром полум'я спиртівки.
1. Великим і вказівним пальцем скло з препаратом взяти за край мазком вгору.
2. Опустити скло в полум'я на 2 секунди, роздавлюючи верхню частину полум'я. Повторити фіксацію ще двічі з тим, щоб загальний час фіксації склал 6 секунд
3. Перевірка фіксації: при дотику скла відразу після фіксації до тильної сторони кисті має відчуватися легке печіння.
Важливо: фіксація повинна бути виконана правильно, забарвлення буде невірне (перетримали в полум'я) або барвник змиється разом з мікроорганізмами (погано зафіксували).

Прості методи фарбування

Способи фарбування препаратів діляться на дві групи: прості (орієнтовні) і складні (диференційні). При простих методах фарбування використовують один барвник. Таке забарвлення дозволяє вивчити форму і розміри мікроорганізмів. Найбільш поширені барвники: метиленовий синій, фуксин Циля (карболової фуксин) та ін
1. На фіксований мазок нанести краплю барвника. Витримати час: для метиленового синього - 5 хвилин, для фуксину - 3 хвилини.
2. Злити надлишок барвника, підсушити мазок шматочком фільтрувального паперу (або підсушити високо над полум'ям спиртівки).
. Мікроскопіровать за допомогою імерсійної системи.

Мікроскопічна картина: метиленовий синій забарвлює всі клітини в синій колір, фуксин - у рожево-червоний колір.

2. Експериментальна частина

Матеріал та обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, культура м/о, етиловий спирт, світловий мікроскоп, предметні скла, розчин фуксину, розчин метиленового синього, імерсійна олія.
2.1. Приготувати фіксований мазок-препарат м/о. Забарвити розчином фуксину (2-3 краплі). Мікроскопувати. Нарисувати мікроскопічну картину.
2.2. Приготувати фіксований мазок-препарат м/о. Забарвити розчином метиленового синього (2-3 краплі). Мікроскопувати. Нарисувати мікроскопічну картину.

3.Контрольні питання

3.1.Правила фіксації препарату.
3.2.Прості методи фарбування фіксованого мазка.
3.3.Загальні правила фарбування мазків.
3.4.Біохімічні аспекти забарвлення мікроорганізмів.

Лабораторна робота № 4. Складні (диференційні) методи фарбування мікроорганізмів

Теоретична частина

Діагностичний метод фарбування за Грамом

Найбільш поширений метод, при якому виявляється здатність бактерій утримувати барвник (грампозитивні бактерії) або знебарвлюватися в спирті (грамнегативні бактерії). Відношення бактерій до фарбування за Грамом визначається їх здатністю утримувати що утворився в процесі фарбування комплекс генціанового фіолетового з йодом. Це залежить від відмінностей у хімічному складі і проникності клітинної стінки Гр «+» і Гр «-» бактерій. У Гр «+» мікроорганізмів пептидоглікан багатошаровий, містить тейхоєві кислоти. У Гр «-» -пептидоглікан одношаровий, є зовнішня мембрана, яка містить фосфоліпіди, ліпопротеїди, білки. Генціанвіолет і йод утворюють міцне та нерозчинне з'єднання з багатошарової муреїновою сіткою Гр «+» бактерій. Гр «-» бактерії такий комплекс не утворюють, їх муреїн одношаровий і фарба з них вимивається.

Фарбування за Грамом

1. На фіксований мазок накладають шматочок фільтрувального паперу і на нього наливають карболовий розчин генціанового фіолетового. Через 1 хв. папір знімають і барвник зливають.
2. На мазок наливають розчин Люголя на 1,5 хв. (мазок чорніє).
3. Злити розчин Люголя і обробити препарат в 95% етанолу протягом 35 сек.
4.. Промити водою.
5. Забарвити розведеним фуксином протягом 2 хв.
6. Змити фарбу, висушити фільтрувальної папером, мікроскопірувати.

Мікроскопічна картина: Гр «+» бактерії фарбуються у фіолетовий колір, Гр «-» - в рожево-червоний.

Фарбування за Цилем-Нільсену

Використовується для фарбування кислотостійких мікробів. Для збільшення ступеня проникності бактерій препарат фарбують фуксином Циля при підігріванні. Пофарбовані кислотостійкі мікроорганізми потім не знебарвлюються слабкими розчинами мінеральних кислот і спиртами
Фіксований мазок покривають фільтрувальної папером і наливають фуксин Циля. Потім, утримуючи препарат пінцетом, підігрівають його над полум'ям спиртівки (h = 10 см) до відходження парів. Повторюють маніпуляцію 2 рази. В міру необхідності додають фарбу не знімаючи папір з препарату. Папір знімають тільки після охолодження препарату.
Препарат знебарвлюють 5% розчином сірчаної кислоти. Потім ретельно промивають водою.
Забарвлюють водно-сп
·иртовим розчином метиленового синього протягом 4 хв., промивають водою, висушують і мікроскопірують.

Мікроскопічна картина: кислотостійкі бактерії фарбуються в рожево-червоний колір, інші форми набувають синє забарвлення.

2. Експериментальна частина

Матеріал та обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, етиловий спирт, світловий мікроскоп, штативи, предметні скла, набір барвників для фарбування за методами Грама та Циля-Нільсона, імерсійна олія, досліджувальна культура м/о.

2.1.Приготувати фіксований мазок-препарат культури мікроорганізмів. Забарвити за методом Граму. Нарисувати. Відмітити Грам-позитивні та Грам-негативні м/о.
2.2. Приготувати фіксований мазок-препарат культури мікроорганізмів. Забарвити за методом Циля-Нільсона. Нарисувати. Відмітити кислотостійкі та кислотонестійки бактерії.

3.Контрольні питання

3.1.Поняття про складні методи фарбування мазків.
3.2.Мікробіологічні та біохімічні аспекти фарбування за методами Грама та Циля-Нільсона.
3.3. Правила фарбування за методом Грама.
3.4. Правила фарбування за методом Циля-Нільсона.

Лабораторна робота № 5. Культивування бактерій. Штучні поживні середовища.
Теоретична частина

Поживні середовища (ПС) служать для виділення чистих культур мікробів з досліджуваного матеріалу та вивчення їх властивостей. До складу середовищ входять неорганічні і органічні компоненти і біоактивні речовини. Неорганічні компоненти поділяються на макроелементи (N, O, C, P, S, Na, Mg, Fe, Н) і мікроелементи (Co, I, Mn, B, Cu). Все макро- та мікроелементи повинні знаходитися в ПС в легкозасвоюваних для даного мікрорганізму з'єднаннях. Органічні компоненти ПС можуть мати рослинне та тваринне походження і є для м/о джерелом азоту. За характером засвоєння азоту м/о поділяються наступним чином: одні з них отримують його з простих амонійних сполук, інші потребують амінокислоти. Треті розщеплюють високомолекулярні речовини - пептони, що представляють собою продукти часткового ферментативного розщеплення білків. Облігатні паразити розмножуються тільки в присутності нативного білка.Ростові фактори представлені групою вітамінів: вітамін А, вітаміни групи В, аскорбінова кислота, нікотинова і парабензойна кислоти.
ПС можуть містити буфер-компоненти для підтримки рН, тому що ряд мікробів виробляють кислоти та зсувають рН в кислий бік, що може зупинити їх зростання.
ПС не можуть бути універсальними для всіх видів м/о, тому що вони володіють індивідуальними особливостями харчування і проявляють свої характерні фізіологічні властивості в певних умовах обміну. Тому на практиці користуються різноманітними ПС стосовно того чи іншого виду мікроорганізму.

Вимоги, що пред'являються до готових ПС
Задовольняти потреби обміну речовин мікробної клітини.
Легко засвоюватися бактеріями.
Містить необхідні солі.
Бути стерильними
Мати оптимальний рН.
Мати достатню вологість.
Утримувати фактори росту.

За складом ПС підрозділяють на природні, штучні і синтетичні.
Природні ПС складаються з натуральних продуктів тваринного або рослинного походження (молоко, овочі, тваринні тканини, жовч).
Синтетичні ПС у своєму складі мають хімічно чисті сполуки, взяті в точних концентраціях (амінокислоти, мінеральні солі, вуглеводи, вітаміни).
По консистенції ПС поділяються на рідкі, напіврідкі, тверді, сипучі і сухі. Рідкі ПС застосовують для вивчення фізіолого-біохімічних особливостей м/о. Ріст бактерій у рідких ПС зазначається візуально по появі каламутності. Найбільш поширена рідка ПС - м'ясо-пептони бульйон (МПБ).
Тверді ПС використовуються для виділення і вивчення властивостей м/о, тому що на них можна отримати ізольоване зростання окремих клітин. Тверді ПС (м'ясо-пептонний агар (МПА)) готують з рідких за допомогою додавання до них 1-2% агар-агару. Агар-агар - складний полісахарид, який утворює гель з точкою плавлення 96-100
· С і температурою застигання 40
· С. Сухі ПС виготовляються у вигляді сухих гігроскопічних порошків, які добре розчиняються у воді при кімнатній температурі.

2.Ескпериментальна частина

Матеріал та обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, штативи, стерильні чашки Петрі з МПА, термостат, етиловий спирт, світловий мікроскоп, предметні скла, набір барвників для фарбування за Грамом, імерсійна олія, досліджувальна культура м/о.
2.1. Приготувати фіксований мазок-препарат культури м/о. Забарвити за методом Граму. Мікроскопувати в імерсійної системі та ідентифікувати культури. Нарисувати.
2.2. Зробити посів на МПА ідентифіковану рідку культуру м/о. Стерильну бактеріальну петлю внести в попередньо приготовлену рідку культуру м/о. Зробити посів на поверхню МПА в чашці Петрі методом «штриху», - «зигзагу». Закрити кришкою, завернути в папір та підписати (прізвища студентів, група дата, вид м/о). Помістити у термостат на 24 год. при температурі 370 С.

3.Контрольні питання

3.1.Фізіологія мікроорганізмів.
3.2. Харчування бактерій. Культивування бактерій.
3.3. Штучні поживні середовища.
3.4. Поняття про ПС. Класифікації ПС.
3.5. Вимоги до готових ПС.
3.6. Методи виконання посівів на тверді та рідкі ПС.

Лабораторна робота № 6. Колонії мікроорганізмів. Вивчення їх культуральних властивостей
1. Теоретична частина
Ознаки відмінності одного виду м/о від іншого:
Морфологічні – форма, розмір, розташування, рухливість клітин.
Тинкторіальні - відношення до фарбування за Грамом. Наявність спор.
Культуральні - характер росту культур на тверді (розмір, колір, прозорість, в'язкість, край колонії) та рідких поживних середовищах.
Колонії - скупчення м/о на поверхні МПА.
Для кожного виду м/о характерний певний зовнішній вигляд колоній, який служить діагностичною ознакою.
При опису колонії вказують вік культури, складу середовища і температуру культивування.
Колонії, що виросли на МПА спочатку дивляться неозброєним оком або через лупу. Для більш якісного дослідження використовують мікроскоп.
Колонію характеризують за такими ознаками: розмір, обриси, консистенція, колір, контури краю, поверхня, профіль, однорідність.

Розмір:
до 1 мм – крапкові;
- 1-2 мм – дрібні;
- 2-4 мм – середні;
- 5 і більше мм – великі.
Обриси: круглі, неправильні, розетковідние, різоїдні, нітковидні, амебовидні, складчасті, складні та ін.
Край: гладкий, хвилястий, зубчастий, лопатевий, неправильний, війчастий, гіллястий, нитчастий, нитчастий, ворсинчастий та ін.
Поверхня: гладка, зморшкувата, покреслена, дрібно - і грубозерниста, волокниста.
Профіль: плоский, плоско-опуклий, опуклий, зігнутий, кратеровидний, який вріс в субстрат, горбистий, каплевидний, конусовидний.
Однорідність: однорідні і неоднорідні.
Консистенція: тверда, м'яка, тягуча.

2. Експериментальна частина

Матеріал та обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, штативи, чашки Петрі з МПА з колоніями мікробів, термостат, етиловий спирт, світловий мікроскоп, предметні скла, набір барвників для фарбування за Грамом.

2.1. Вивчити культуральні властивості колоній м/о. Нарисувати. Заповнити таблицю.


Вид колонії м/о
Розмір
Обрис
Краї
Поверхня
Профіль
Однорідність
Консистенція
Колір



2.2. Вивчити тинкторіальні властивості колоній. Приготувати фіксовані мазки-препарати з різних колоній, що виросли на МПА. Пофарбувати за Грамом. Мікроскопіровати в імерсійної системі. Нарисувати.

3.Контрольні питання

3.1. Поняття про морфологічні ознаки для ідентифікації видів мікроорганізмів.
3.2. Поняття про тинкторіальні ознаки для ідентифікації видів мікроорганізмів.
3.3. Поняття про культуральні ознаки для ідентифікації видів мікроорганізмів.

Лабораторна робота № 7. Стерилізація. Методи стерилізації
1. Теоретична частина
Стерилізація - процес умертвіння в об'єкті або видалення з нього мікроорганізмів всіх видів, що знаходяться на всіх стадіях розвитку. Для стерилізації використовують такі методи:
-термічні;
-хімічні;
-стерилізація фільтруванням;
-фізичні методи стерилізації (ультрафіолетові (УФ) промені, ультразвук, радіація).

Термічні методи стерилізації
Стерилізація парою здійснюється насиченим водяною парою при надлишковому тиску 1 - 2 атм і температурі 120
· С в автоклаві. Стерилізують живильні середовища МПА, МПБ, посуд, перев'язувальний матеріал, хірургічні інструменти.
Автоклавування - найшвидший і надійний спосіб стерилізації, при якому гинуть всі форми м / о і спори.
Прожарювання на полум'ї (фламбіровання) - використовують при стерилізації дрібних металевих та скляних предметів (бактеріологічні петлі, пінцети, предметні скла). Відбувається згорання всіх видів м/о.
Кип'ятіння - простий спосіб стерилізації металевих та скляних предметів (голок, шприців, хірургічних інструментів, гумових трубок та ін.) Кип'ятіння триває від 15-30 хв. до 2 годин при t = 100
· С.
Стерилізація текучим пором застосовується в тих випадках, коли стерилізується матеріал змінює свої властивості при температурі понад 100
· С. Таким способом стерилізують вітаміни, вуглеводи, молоко. Проводиться в апараті Коха або в автоклаві з незакріплений кришкою. Стерилізується об'єкти прогрівають на водяній бані 15-60 хв при t = 60 - 90
· С. Для повного знищення спор застосовують дробову стерилізацію: нагрівають стерилізується матеріал текучим парою при 100
· С 30 хв 3 рази через кожні 24 години.
Тіндалізація - вид дробової стерилізації. Що застосовується до об'єктів, розкладаються при 100
· С (вітаміни і т.д.). Об'єкти стерилізують по 60 хвилин 3 -5 раз при t = 60 - 80
· С.
Пастерізація - прийом часткової стерилізації. Застосовують для рідких середовищ, які змінюють свої фізико-хімічні властивості при високій температурі. Пастеризації піддають харчові продукти: молоко, вино, пиво, соки та ін При пастеризації повністю зберігаються вітаміни і смакові якості продуктів. Пастеризовані продукти довго не зберігаються так як, при цьому способі вегетативні форми м / о гинуть, а спори залишаються. У мікробіологічної лабораторній практиці пастеризацією відокремлюють спороутворюючі види бактерій від неспороутворюючих. Пастеризацію проводять на водяній бані при t = 60 - 80
· С протягом 10-30 хвилин.

Хімічні методи стерилізації

Хімічна стерилізація (дезінфекція) - знищення патогенних мікробів за допомогою отруйних речовин (антисептиків). Рекомендується для виробів з полімерних матеріалів, гуми, скла, корозійно-стійких матеріалів. Для стерилізації використовуються гази і дезінфіцірующте розчини: окис етилену, перекис водню, спирти, кислоти, фенол. Стерилізацію дезрастворе проводять у закритих ємностях зі скла, пластмаси, емальованих ємностях. Вироби повністю занурюють у дезрастворе і витримують від 1 до 24 годин. Після цього вироби повинні бути промиті стерильною водою в асептичних умовах.

Стерилізація фільтруванням
Розчини термолабільних речовин (розчини білків, сироватки, деякі вітаміни) стерилізують фільтруванням за допомогою мембранних і глибинних фільтрів. Діаметр пір мембранних фільтрів не перевищує 0,3 мкм. Для фільтрів використовують синтетичні полімери, целюлозу, волокнисті матеріали (бавовна, вовна, азбест). Фільтрування ведуть в умовах вакууму або під тиском.

Фізичні методи стерилізації

Фізичні методи (УФ-промені, ультразвук, радіоактивне випромінювання) використовують для стерилізації термолабільних матеріалів. Високі дози випромінювання вбивають більшість патогенних організмів. УФ-промені (діапазон 200-280 нм) бактерицидні і застосовуються для дезінфекції повітря в приміщеннях, стерилізації виробів з полімерів і т.д. Радіаційна стерилізація рекомендована для стерилізації виробів одноразового використання в упаковці, перев'язувальних матеріалів, виробів із пластмас. Опромінення проводять на різних установках іонізуючого опромінення (дози до 25 кГр).

2. Експериментальна частина

Матеріал та обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, штативи, чашки Петрі з МПА, термостат, культура м/о, УФ-бокс, фольга, етиловий спирт, світловий мікроскоп, предметні скла, набір барвників для фарбування за Грамом.

Вивчення антибактеріальної дії УФ-променів

2.1. Провести посів попередньо ідентифікованої культури м/о (приготування фіксованого мазка-препарата, фарбування по Граму) на чашку Петрі з МПА. Посів проводиться в стерильних умовах у боксі
2.2. Половину чашки Петрі закрити стерильною фольгою.
2.3. Провести опромінення відкритої частини чашки Петрі бактерицидної лампою протягом 30 хв.
2.4. Інкубувати посів у термостаті протягом доби при температурі 37
· С. Про ступінь антибактеріальної дії УФ-променів судять по відсутності росту бактерій на опроміненій половині чашки Петрі.
3. Контрольні питання

3.1. Методи термічної стерилізації (автоклавування, фламбіровання, пастеризація, тіндалізація та ін.).
3.2. Хімічні методи стерилізації. Дезінфекція. Асептика та антисептика.
3.3. Стерилізація фільтруванням.
3.4. Фізичні методи (УФ-промені, ультразвук, радіоактивне випромінювання).

Лабораторна робота № 8. Мікробіологічне дослідження повітря

1. Теоретична частина

Санітарно-бактеріологічний аналіз повітря проводять з метою визначення біологічного показника забруднення мікрофлорою носоглотки людини, а також безпосереднього виявлення патогенних стафілококів, синьогнійної паличок та інших грамнегативних умовно-патогенних бактерій - збудників внутрішньолікарняних інфекцій. Для повітря санітарно-показовими мікроорганізмами обрано - Streptococcus haemolyticus, Streptococcus viridans, Staphylococcus aureus.
Санітарно-бактеріологічний аналіз повітря закритих приміщень проводять методом осідання на чашки (седиментації) і аспіраційних способом за допомогою приладу Кротова.
Метод седиментації. У приміщеннях, де проводять мікробіологічний аналіз повітря, встановлюють відкриті чашки з МПА на 20 хв. Потім чашки закривають і інкубують в термостаті при 37
· С 24 години. Після чого підраховують число вирослих колоній, вимірюють діаметр чашки з метою визначення її площі.
Для підрахунку кількості м/о на 1 м3 досліджуваного повітря використовують формулу Омеленского. Вона виведена на підставі експериментальних досліджень, які показали, що на площі чашки Петрі, в межах 100 см3 за 5 хвилин осідає стільки м/о, скільки їх міститься у 10 дм3 повітря. Повітря вважається чистим у мікробіологічному відносно якщо в 1 м3 мікробне число не більше 1000.
N - мікробне число, а - число колоній МПА; F - площа чашки Петрі; t - час експозиції.
13 EMBED Equation.3 1415

2. Експериментальна частина

2.1. Визначення мікробного числа повітря.
2.1.1. Стерильну чашку Петрі з МПА відкрити і витримати в приміщенні протягом 20 хвилин. Потім чашку закрити, підписати і інкубувати в термостаті протягом 24 годин при температурі 37
· С.
2.1.2. Розрахувати мікробне кількість повітря за формулою Омеленского.
2.2. Вивчити тинкторіальних і культуральні властивості всіх м / о з посіву повітря.
2.2.1. Зарисувати всі виросли колонії на чашці.
2.2.2. Приготувати фіксований мазок-препарат кожного виду м / о. Фарбувати за Грамом. Дослідити в імерсійної системі.
2.2.3. Заповнити таблицю.

Вид колонії м/о
Розмір
Обрис
Краї
Поверхня
Профіль
Однорідність
Консистенція
Колір


3. Контрольні питання

3.1. Методи визначення мікробного числа повітря.
3.2. Мікробіологічні нормативи повітря приміщень (аудиторія, коридор, лабораторія, туалет, столова).


Лабораторна робота № 9. Санітарно-мікробіологічне дослідження води. Визначення мікробного числа води

1. Теоретична частина

Санітарно-мікробіологічне дослідження води проводять з метою санітарного контролю і за епідеміологічними показниками на наявність патогенних бактерій і ентеровірусів. Для води санітарно-показковими мікроорганізмами обрано - E. coli, Streptococcus faecalis.Визначення мікробного числа води передбачає дослідження загальної кількості аеробів і факультативних анаеробів в 1 мл досліджуваної води, здатних при 37
· С протягом 24 годин утворювати на МПА колонії, які видимі неозброєним оком і при збільшенні в 2-5 разів. У залежності від ступеня забруднення води готують послідовно 10-кратні розведення від 1: 10 для чистих до 1:10 000 для стічних вод.Мікробне число питної води не повинно перевищувати 100 мікробних клітин в 1 мл.



Експериментальна частина

Матеріал та обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, штативи, стерильні чашки Петрі з МПА, термостат, культура м/о, етиловий спирт, світловий мікроскоп, предметні скла, набір барвників для фарбування за Грамом.

Мікробіологічний аналіз водопровідної води

Набрати 1 мл досліджуваної води в стерильний шприц, внести її в стерильну чашку Петрі і зверху залити 10 - 12 мл розтопленого і охолодженого до 45
· С МПА.
Потім чашку закрити, підписати і інкубувати в термостаті протягом 24 годин при температурі 37
· С.
Вивчити тинкторіальні і культуральні властивості всіх м/о з посіву води.
Підрахувати за допомогою лупи всі колонії м/о, що виросли на чашці Петрі. Нарисувати.
Приготувати фіксований мазок-препарат кожного виду м/о. Пофарбувати за Грамом. Дослідити в імерсійної системі. Визначити мікробне число води.
Заповнити таблицю. Визначити мікробне число води та вказати на відповідність санітарно-мікробіологічним нормам.


Вид колонії м/о
Розмір
Обрис
Краї
Поверхня
Профіль
Однорідність
Консистенція
Колір



3. Контрольні питання

3.1. Поняття про мікробіологічний контроль водопровідної води.
3.2. Поняття про мікробіологічний аналіз води.
3.3. Мікробіологічні нормативи для водопровідної води, колодязної води, води натуральних водойомів (озера, ріки, ставки) та ін.
















Література

Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии / Под. ред. В.В. Теца. – Изд. 2-е, перераб. и доп. – М.: Медицина, 2002. – 352с.
Микробиология: Руководство к лабораторным занаятиям: Учеб. пособие для студентов высш. учеб. заведений / И. Л. Дикий, И.И. Сидорчук, И. Ю. Холупяк и др. – Х.: Узд-во НфаУ: Золотые страницы, 2002. – 444 с.








Root Entry

Приложенные файлы

  • doc 265856
    Размер файла: 158 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий