иммунология

Антитела (иммуноглобулины, ИГ, Ig) особый класс гликопротеинов, присутствующих на поверхности B-лимфоцитов в виде мембраносвязанных рецепторов и в сыворотке крови и тканевой жидкости в виде растворимых молекул, и обладающих способностью очень избирательно связываться с конкретными видами молекул, которые в связи с этим называют антигенами. Антитела являются важнейшим фактором специфического гуморального иммунитета. Антитела используются иммунной системой для идентификации и нейтрализации чужеродных объектов например, бактерий и вирусов. Антитела выполняют две функции: антиген-связывающую и эффекторную (вызывают тот или иной иммунный ответ, например, запускают классическую схему активации комплемента).

Антитела синтезируются плазматическими клетками, которыми становятся некоторые В-лимфоциты, в ответ на присутствие антигенов. Для каждого антигена формируются соответствующие ему специализировавшиеся плазматические клетки, вырабатывающие специфичные для этого антигена антитела. Антитела распознают антигены, связываясь с определённым эпитопом характерным фрагментом поверхности или линейной аминокислотной цепи антигена.

Антитела состоят из двух лёгких цепей и двух тяжелых цепей. У млекопитающих выделяют пять классов антител (иммуноглобулинов) IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, различающихся между собой по строению и аминокислотному составу тяжёлых цепей и по выполняемым эффекторным функциям.

Строение антител

Общий план строения иммуноглобулинов: 1) Fab; 2) Fc; 3) тяжелая цепь; 4) легкая цепь; 5) антиген-связывающийся участок; 6) шарнирный участок

Антитела являются относительно крупными (~150 кДа IgG) гликопротеинами, имеющими сложное строение. Состоят из двух идентичных тяжелых цепей (H-цепи, в свою очередь состоящие из VH, CH1, шарнира, CH2 и CH3 доменов) и из двух идентичных лёгких цепей (L-цепей, состоящих из VL и CL доменов). К тяжелым цепям ковалентно присоединены олигосахариды. При помощи протеазы папаина антитела можно расщепить на два Fab (англ. fragment antigen binding антиген-связывающий фрагмент) и один Fc (англ. fragment crystallizable фрагмент, способный к кристаллизации). В зависимости от класса и исполняемых функций антитела могут существовать как в мономерной форме (IgG, IgD, IgE, сывороточный IgA), так и в олигомерной форме (димер-секреторный IgA, пентамер IgM). Всего различают пять типов тяжелых цепей (
·-,
·-,
·-,
·-и
·- цепи) и два типа легких цепей (
·-цепь и
·-цепь).

Что такое иммуноглобулины?
Иммуноглобулины – это те самые антитела, которые являются одним из главных факторов иммунитета. Защитные процессы постоянно протекающие в нашем организме чрезвычайно сложны. Иммуноглобулины участвуют в осуществлении функций гуморального иммунитета – то есть, защиты, действующей в биологических жидкостях: тканевой жидкости, лимфе, сыворотке крови.

Антитела – обеспечивают специфический иммунитет, то есть защиту от конкретных возбудителей болезней, чужеродных тканей, токсинов и так далее - антигенов. Например, при встрече организма с вирусом герпеса, в его крови вырабатываются антитела именно к данному виду вируса герпеса (а не ко всем его видам или не ко всем вирусам вообще).
Механизмы действия иммуноглобулинов
Сильно упрощая запутанные пути биохимических превращений, можно сказать, что первая функция антител – облепить поверхность антигена. Таким образом, другие клетки, отвечающие за уничтожение вирусов, бактерий, грибов, прочих факторов, способных разрушить наше здоровье, получают сигнал, где их цель – двигаются к ней и начинают ее растворять, поглощать, выводить из организма.

Вторая функция – запустить другие механизмы реакции: воспаление, аллергию и так далее.
Виды антигенов и иммуноглобулинов
Против возбудителей инфекций действуют антиинфекционные антитела.
Против токсинов, которые выделяют возбудители, действуют антитоксические антитела.
Против тканей представителей того же биологического вида (тканей другого человека, например, при пересадке) действуют аллоантитела.
Против тканей представителей другого биологического вида действуют изоантитела.
Избыток антител уничтожают антиидиотипические антитела.
Развитие аутоиммунных заболеваний, когда разрушаются ткани самого организма, связано с образованием аутоантител, «борющихся» с собственными тканями.
Наконец, существуют антитела-свидетели, которые появляются при столкновении организма с инфекцией, но никак не влияют на ее развитие.
Классификация иммуноглобулинов
IgA – иммуноглобулины, которые осуществляют первичную защиту организма, находясь в слюне, слезах, на слизистой дыхательных путей, половых органов.

IgD – очевидно, участвуют в «специализации» лимфоцитов, «нацеливая» их на разные антигены.

IgM – самые ранние антитела, которые возникают при первой встрече организма с антигеном. При обнаружении иммуноглобулинов этого класса, например, к вирусу ветряной оспы, можно сказать, что человек недавно впервые столкнулся с этой инфекцией.
Иммуноглобулины IgG
Основной иммуноглобулин в крови человека - и по многофункциональности, и по количеству в сыворотке. Это антитела, отвечающие за длительный иммунитет. Это единственный иммуноглобулин, который передается от матери – ребенку, проникая через плацентарный барьер, и позволяет сформировать пассивный иммунитет на первые месяцы жизни малыша, пока у него вырабатываются собственные антитела.

Данный иммуноглобулин получают из крови здоровых доноров и вводят в виде лекарства, например, при тяжелых инфекционных заболеваниях или в качестве заменителя собственных антител при иммунодефиците. Лечение с применением Иммуноглобулина человеческого нормального – сложный процесс, который может проходить только под наблюдением врачей.
Иммуноглобулины IgЕ
Эти антитела, также, находятся на слизистых и активируют защиту организма, если «линия обороны» антител IgA – «прорвана». Данные иммуноглобулины запускают механизмы воспаления, аллергии, «призывают» к месту «вторжения» все прочие клетки и антитела IgG. В сыворотке этих антител ничтожно мало, но при развитии аллергических заболеваний, например, бронхиальной астмы или крапивницы – они обнаруживаются в больших количествах.
Диагностика заболеваний при помощи определения иммуноглобулинов
Медицина не только изучила функции антител в организме, но и разработала методы анализа, благодаря которым можно прояснить картину наличия тех или иных иммуноглобулинов у конкретного пациента (см. иммунограмма). Это позволяет диагностировать заболевание, не обнаруживая сам возбудитель, а только антитела к нему.

Например, если преобладают IgM (антитела данного класса против определенного возбудителя) – значит, инфекция проникла в организм недавно. Если же специфических IgM нет, но присутствуют IgG к данному возбудителю – значит эта «встреча» произошла давно (возможно или полное излечение или переход инфекции в хроническую форму). IgE, как мы уже сказали, присутствуют при активном аллергическом процессе. И так далее.

Классификация иммуноглобулинов основана на трех формах гетерогенности этих белков: изотипы, аллотипы и идиотипы. Изотипы это различные варианты, которые в сыворотке крови каждого индивида представлены пятью классами и очень многими подклассами, причем все изотопические варианты у всех людей идентичны. Аллотипы являются генетическими иммупоглобулиновыми маркерами. При этом различные аллели обусловливают вариабельность первичной структуры цепей иммуноглобулинов. Таким образом, в данном случае речь идет уже о генетически обусловленном полиморфизме, поэтому каждый человек имеет лишь определенные структурные аллотипические варианты, которые он унаследовал от своих родителей. Различия между изо-и аллотипами проявляются и в другом. Так, если изотипы отличаются друг от друга по структурным компонентам общей С-части полипептидных цепей, позволяющим разделить их на 5 классов и множество подклассов, то аллотипы отличаются друг от друга лишь тончайшими различиями в первичной структуре С-частей полипептидиых цепей, часто проявляющимися перестановкой в цепи одной или нескольких аминокислот. Из этого следует, что аллотипы чаще всего являются классо – и подклассоспецифичиыми.

В настоящее время у человека найдены четыре независимые друг от друга и всех других генетических маркеров крови генетические полиморфные иммуноглобулн-новые системы.

1. Gm-система. Генетический маркер у-цепей, поэтому полиморфизм системы проявляется только в гаммаиммуноглобулиновых молекулах.
2. InV-система. Генетический маркер L-цепей Н-ти-па, поэтому факторы системы InV обнаруживаются во всех Ig-молекулах, участвующих в «строительстве» И-цепей независимо от их класса и подкласса.
3. Фактор ISf. Генетический маркер yi-цепи, поэтому он выявляется только в IgGi-молекулах.
4 Анти-система. Генетический маркер аг-цепей, поэтому факторы этой системы могут быть обнаружены только в ]д.2-молекулах. Идиотипы характеризуются чрезвычайно многочисленными структурными вариантами в V-частях Ig-цепей. Они представляют собой биологически чрезвычайно важную гетерогенность иммуноглобулинов, поскольку определяют антигенную специфичность молекулы. Хотя число различных вариантов идиотипов у человека колеблется в пределах 105ilO7, для серологии групп крови идиотипы до сих пор не имеют никакого значения.

2.
Сущность серологических методов исследования состоит в определении титра антител в сыворотке крови больного в динамике болезни по отношению к известному антигену, вводимому в серологическую реакцию.

В клинической практике чаще всего используется реакция агглютинации (РА) Видаля, ее разновидности, РНГА, РСК и более информативные современные методы (ИФА, РИА, ЛИФА и др.).

РА определение неизвестных антител с помощью известных антигенов и установление вида возбудителя с помощью известных антител. РИГА и РНГА более специфичны, используются меченные эритроциты. РТГА основан на способности некоторых вирусов агглютинировать эритроциты. РИ реакция иммунодиффузии, различная способность антигенов и антител диффундировать в геле. РСК титрование антигенов или антител по степени фиксации комплемента с комплексом антиген-антитело. PH - способность антител нейтрализовать токсины и антигены вирусов. ИФА используются антитела, конъюгированные с ферментом. РИА используется радиоактивная метка антигенов или антител. ЛИФА лантанидный иммунофлюоресцентный анализ используются в качестве метки элементы редкоземельных металлов.

Забор крови для серологического исследования выполняется так же, как и при посеве, но в отличие от последнего, его лучше осуществлять самотеком, а не шприцом. Для этого берут иглу с более широким просветом и вводят в локтевую вену без шприца. В пробирку собирают 35 мл крови. При таком сборе эритроциты меньше травмируются и сыворотка крови реже бывает с явлениями гемолиза. После отстаивания и центрифугирования крови сыворотку с помощью пипетки переносят в другую пробирку или эпиндорф и хранят в холодильнике при температуре +4 °С до постановки реакции. Поскольку иммунный ответ при большинстве инфекционных болезней развивается с 5-7-го дня, а максимальное нарастание титра антител происходит лишь в периоде реконвалесценции, серологические методы менее пригодны для ранней диагностики и используются главным образом в целях ретроспективной расшифровки этиологии уже перенесенного инфекционного заболевания.

Однако кровь для серологических исследований берется и в первые дни болезни, что в дальнейшем дает возможность наблюдать за нарастанием титра антител в динамике заболевания. Повторные серологические исследования при бактериальных инфекциях производятся не раньше, чем через 5-7 дней. При вирусных заболеваниях берутся «парные сыворотки» с интервалом 10-12 дней и при нарастании титра антител в 4 раза и более подтверждается диагноз предполагаемого заболевания.

Если живой или мертвый патоген, его часть или продукт метаболизма попадают в организм хозяина, то белки и углеводы, из которых построены указанные выше части, воспринимаются этим организмом как чужеродные или аналогичные тем, из которых построен он там. Такой инородный материал называется антигеном. Как только антиген попадает в организм, сразу же начинается процесс образования его специфических антиподов, которые называются антителами (белок, обладающий способностью соединяться только с антигеном), или начинается выработка клеток, обладающих специфическим сродством к этому антигену.

Вначале образование антител идет медленно, и в течение первых 23 дней их присутствие установить трудно. Для образования количества антител, достаточного для того, чтобы повлиять на ход инфекционного процесса путем инактивации патогена, требуется от недели до 10 дней. Поэтому между накоплением патогена и увеличением выработки антител устанавливается конкурентная зависимость. Когда заболевание пройдет и весь патогенный материал будет выведен из организма, образование специфических антител еще продолжается, но с убывающей скоростью. Через несколько месяцев даже с помощью самых чувствительных лабораторных тестов не удается обнаружить антитела в крови и тканевых жидкостях, и не остается никаких признаков контакта животного с антигеном. Однако иммунологическая память к данному антигену сохраняется на длительный срок, порой на всю жизнь. Если этот же антиген впоследствии проникнет в организм, реакция бывает очень быстрой. Антитела появляются через 12 дня и при вторичном иммунном ответе образуются в значительно большем количестве, чем при первичном (рис. 35). Запоминание антигена и вторичный иммунный ответ имеют большое значение для вакцинации. Вторичный ответ подобного типа имеет место и в реакциях клеточной иммунной системы.

Иногда вторичный ответ называют анамнестической реакцией (т.е. незабытой реакцией). Этим термином правильнее было бы назвать истинную вторичную иммунологическую реакцию, возникающую при первичном введении антигена. Животные, у которых проявляется эта реакция, фактически оказываются уже стимулированными таким же антигеном или антигеном, который вступает в прямые перекрестные реакции с первым.

Выражение «тот же самый», используемое при описании паразита, следует понимать в самом прямом смысле. Специфичность реакций антител такова, что очень небольшие различия в конфигурации структурных молекул паразитического организма могут сделать его совершенно отличным от того организма, к которому антитела уже образовались, в результате чего последние не могут взаимодействовать с данным организмом, и его внедрение не стимулирует вторичного иммунного ответа. Например, разные представители одного вида трипанозом могут иметь огромное число различных поверхностных оболочек. Образование антител против одной из них и возникший в результате этого иммунитет не является защитой против любой другой трипанозомы.

3. Специфигеские методы лабораторной диагностики имеют особое значение для диагностики инфекционных заболеваний. Их подразделяют на несколько групп.

1. Выделение возбудителя бакте
риологический и вирусологический методы.

2. Визуализация возбудителя бактериоскопическое, вирусоскопическое, паразитологическое исследование.

3. Выявление антигенов возбудителя (экспресс-диагностика):

РИФ реакция иммунофлюоресценции;

РНИФ реакция непрямой иммунофлюоресценции;

РИМ радиоиммунологический метод;

ИФА иммуноферментный анализ;

ПЦР полимеразная цепная реакция;
РА реакция агглютинации;

РЛА реакция латексагглютинации;

РПГА реакция пассивной гемагглютинации;

РНГА реакция непрямой гемагглютинации;

РСК реакция связывания комплемента;

РТГА реакция торможения гемагглютинации.

4. Обнаружение специфических антител (серологическая диагностика): РА, РЛА, РПГА, РНГА, РСК, РТГА, ИФА, РИМ.

5. Кожные аллергические пробы.

6. Морфологические методы.

Реакцию агглютинации (РА) используют для определения специфических антител с помощью известного антигена, а также с целью установления вида микроба с помощью известных антител. Она широко используется для диагностики брюшного тифа (брюшнотифозный Видаль), стафилококковой инфекции (стафилококковый Видаль), иерсиниоза, бруцеллеза (реакция Райта, реакция Хеддлсона).

Модификация РА, при которой на носитель (частица латекса) наносят очищенные антигены, называется реакцией латексной агглютинации (РЛА). В настоящее время она применяется для диагностики дифтерии, коклюша, ВИЧ-инфекции, менингококковой, гемофильной, пневмококковой и кишечных инфекций.
Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) по чувствительности превышает реакцию агглютинации. Это достигается использованием эритроцитов, на поверхности которых сорбируются антигены (бактериальные и вирусные) или антитела. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенными эритроцитарными диагностикумами и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами, именуют иммуноглобу-линовыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов.


РНГА широко используется для диагностики острых кишечных инфекций, коклюша, ОРВИ, дифтерии, боррелиоза и др.

Реакция связывания комплемента (РСК) позволяет титровать антигены или антитела по степени фиксации комплемента комплексом антиген-антитело. Она широко применяется для диагностики вирусных, микоплазменных, риккетсиозных инфекций, а также для выявления антител к возбудителям цитомегалии, токсоплаз-моза, бруцеллеза, гонореи, сифилиса. Метод высокочувствителен и специфичен.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на способности некоторых вирусов (гриппа, арбовиру-сов) вызывать агглютинацию эритроцитов. Сущностью реакции является феномен предотвращения (торможения) гемагглютинации эритроцитов вирусами под действием иммунной сыворотки.

РТГА вспомогательный лабораторный метод серодиагностики кори, краснухи, гриппа, клещевого энцефалита, полиомиелита и других вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглю-тинирующими свойствами.

Диагностическую значимость серологических исследований можно повысить, применяя дифференцированное определение антител, относящихся к разным классам иммуноглобулинов (IgM и IgG):

IgM образуются в ранние сроки болезни и являются маркерами недавнего инфицирования; IgG появляются в более поздние сроки заболевания, сохраняются длительно и обусловливают постинфекционный иммунитет.

Определение различных классов иммуноглобулинов при однократном исследовании крови больного проводится методом ИФА. С помощью этого метода верифицируют вирусные гепатиты, определяют характер течения таких заболеваний, как ВИЧ-инфекция, токсоплазмоз, герпетическая инфекция, цитомегалия, хламидиоз, микоплазмоз. ИФА наиболее перспективный метод диагностики практически всех вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций, широко применяется в клинической практике.
РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ, РНГА
(Indirect hemagglutination test)
·

- метод выявления антигенов и антител, основанный на способности эритроцитов, на поверхности которых предварительно адсорбированы антигены или антитела, агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток или соответствующих антигенов.

При обнаружении антигенов реакция обозначается обратной пассивной гемагглютинацией - РОПГА (reversed passive hemagglutination test), а при обнаружении антител - пассивной гемагглютинацией - РПГА (passive hemagglutination test). РНГА нашла широкое применение для выявления серологических маркеров инфицирования вирусом гепатита В, особенно HBsAg и антител к нему.

В настоящее время разработаны различные методы изготовления эритроцитарных диагностикумов, отличающихся по способам сенсибилизации эритроцитов (с помощью танина, глютарового альдегида, хлористого хрома, риванола и т.п. ), их видовой принадлежности (человека, барана, курицы, индюка и т. д. ), вариантам постановки реакции (в планшетах для микротитрования, в пробирках, капиллярах и т. д. ) и учета результатов (визуальный и инструментальный). Эритроцитарные диагностикумы для выявления HBsAg и анти-HBs выпускаются многими предприятиями и фирмами как у нас в стране, так и за рубежом.

Чаще РНГА проводится в планшетах для микротитрования, в которых предварительно приготовляются разведения исследуемой сыворотки и контрольных образцов. После внесения эритроцитарного диагностикума и инкубации проводится учет результатов реакции. Положительными считают образцы, в которых происходит агглютинация эритроцитов, имеющая вид перевернутого “зонтика”. При отрицательной реакции эритроциты оседают на дно лунки в виде кольца или диска.

Для подтверждения специфичности полученных результатов реакция ставится как с “опытным” эритроцитарным диагностикумом (т. е. эритроциты, сенсибилизированные антигеном или антителами), так и с “контрольным” диагностикумом (т. е. эритроциты не сенсибилизированы антигеном или антителами). Наличие позитивной реакции с “контрольным” диагностическим препаратом свидетельствует о ложнопозитивной реакции. Для устранения неспецифических реакций исследуемую сыворотку обрабатывают несенсибилизированными эритроцитами. Обязательным условием проведения РНГА является реакция нейтрализации, т. е. конфирмационный тест.

По сравнению с такими методами, как РПГ, ВИЭФ и РСК, реакция непрямой гемагглютинации обладает более высокой чувствительностью (в 200 - 400 раз). Так, HBsAg в РПГА может быть выявлен в концентрациях 6-10 нг/ мл. Простота проведения реакции и экспрессность (20 - 30 минут) определили широкое применение данного метода в службе переливания крови для выявления HBsAg.

Кроме эритроцитарных диагностикумов для выявления HBsAg и анти-HBs разработаны диагностические препараты и для вы- явления анти-НВс, анти-НВс класса IgM (твердофазный вариант), HBeAg, антигена вируса гепатита А и антител к нему, однако, все они не нашли применения в практическом здравоохранении.

4.
Иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг. Механизм, компоненты, применение.

Иммуноферментный анализ или метод выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях (1010-1012 г/л).

Твердофазный ИФА вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания,

I. При определении антител (левый рисунок) в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, ме­ченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.

II. При определении антигена (правый рисунок) в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр. сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента.

Конкурентный ИФА для определения антигенов: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки.

Другой тест - конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с дру­гом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

Иммуноблоттинг высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

Механизм реакции

В основе иммуноферментного анализа лежит иммунная реакция антигена с антителом, а присоединение к антителам ферментной метки позволяет учитывать результат реакции антиген-антитело по появлению ферментативной активности или по изменению ее уровня. В упращенном виде механизм реакции можно представитьследующим образом:

Первая реакция происходит между определяемым Ig (Ab) и очищенным антигеном возбудителя (Ag), фиксированным к поверхности лунок иммунологического планшета



Для выявления образовавшихся иммунных комплексов проводят вторую иммунологичесую реакцию, в которой в качестве антигена выступает связавшийся специфический Ig, а в качестве антител к нему коньюгат, представляющий собой Ig (Ab) к соответствующему Ig человека, меченный ферментом -пероксидазой (K)

Отрицательный результат - отсутствие окрашивания
Положительный результат - окрашивание


Далее происходит ферментативная реакция, катализируемая ферментной частью молекулы коньюгата. Субстратом данной реакции служит бесцветное вещество хромоген, который в ходе реакции образует окрашенное вещество. Интенсивность окраски в лунке определенным образом зависит от количества содержащихся в пробе иммуноглобулинов.

После остановки реакции проводят фотометрирование лунок с помощью специальных приборов, для учета результатов используют специальные приборы. При сравнении со значений оптической плотности контрольных проб проводят математическую обработку результатов анализа. Чем выше оптическая плотност в данной ячейки, тем большее количество специфических антител содержится в пробе

При измерении оптическую плотности (ОП) жидкости в ячейке и сравнивании ее с контрольным образцом подсчитывается концентрация антител в единицах объема. Наиболее часто применяется подсчет результатов в единицах оптической плотности. Надо учитывать, что для каждой тест-системы есть свои показатели учета результатов и показатели нормы и патологии на которые надо ориентироваться при интерпретации результатов.

Как интерпретировать результаты ИФА

Исследование наличия и уровня антител различных классов в некоторых случаях помогает определить стадии инфекционного процесса

5.
Виды вакцин

Все вакцины подразделяются на живые и инактивированные. Инактивированные вакцины, в свою очередь, делят на:

Корпускулярные
- представляют собой бактерии или вирусы, инактивированные химическим (формалин, спирт, фенол) или физическим (тепло, ультрафиолетовое облучение) воздействием. Примерами корпускулярных вакцин являются: коклюшная (как компонент АКДС и Тетракок), антирабическая, лептоспирозная, гриппозные цельновирионные, вакцины против энцефалита, против гепатита А (Аваксим), инактивированная полиовакцина (Имовакс Полио, или как компонент вакцины Тетракок).

Химические
- создаются из антигенных компонентов, извлеченных из микробной клетки. Выделяют те антигены, которые определяют иммуногенные характеристики микроорганизма. К таким вакцинам относятся: полисахаридные вакцины (Менинго А+С, Акт-ХИБ, Пневмо 23, Тифим Ви), ацеллюлярные коклюшные вакцины.

Рекомбинантные
- для производства этих вакцин применяют рекомбинантную технологию, встраивая генетический материал микроорганизма в дрожжевые клетки, продуцирующие антиген. После культивирования дрожжей из них выделяют нужный антиген, очищают и готовят вакцину. Примером таких вакцин может служить вакцина против гепатита В (Эувакс В).

Инактивированные вакцины выпускают как в сухом (лиофилизированном), так и в жидком виде.

Живые
Живые вакцины изготовляют на основе ослабленных штаммов микроорганизма со стойко закрепленной авирулентностью (безвредностью). Вакцинный штамм, после введения, размножается в организме привитого и вызывает вакцинальный инфекционный процесс. У большинства привитых вакцинальная инфекция протекает без выраженных клинических симптомов и приводит к формированию, как правило, стойкого иммунитета. Примером живых вакцин могут служить вакцины для профилактики краснухи (Рудивакс), кори (Рувакс), полиомиелита (Полио Сэбин Веро), туберкулеза, паротита (Имовакс Орейон).
Живые вакцины выпускаются в лиофилизированном (порошкообразном) виде (кроме полиомиелитной).

Анатоксины
Эти препараты представляют собой бактериальные токсины, обезвреженные воздействием формалина при повышенной температуре с последующей очисткой и концентрацией. Анатоксины сорбируют на различных минеральных адсорбентах, например на гидроокиси алюминия. Адсорбция значительно повышает иммуногенную активность анатоксинов. Это связано как с созданием "депо" препарата в месте введения, так и с адъювантным действием сорбента, вызывающего местное воспаление, усиление плазмоцитарной реакции в регионарных лимфатических узлах. Анатоксины обеспечивают развитие стойкой иммунологической памяти, этим объясняется возможность применения анатоксинов для экстренной активной профилактики дифтерии и столбняка.

Состав
Кроме основного действующего начала в состав вакцин могут входить и другие компоненты - сорбент, консервант, наполнитель, стабилизатор и неспецифические примеси. К последним могут быть отнесены белки субстрата культивирования вирусных вакцин, следовое количество антибиотика и белка сыворотки животных, используемых в ряде случаев при культивировании клеточных культур.
Консерванты входят в состав вакцин, производимых во всем мире. Их назначение состоит в обеспечении стерильности препаратов в тех случаях, когда возникают условия для бактериальной контаминации (появление микротрещин при транспортировке, хранение вскрытой первичной многодозной упаковки). Указание о необходимости наличия консервантов содержится в рекомендациях ВОЗ.
Что касается веществ, используемых в качестве стабилизаторов и наполнителей, то в производстве вакцин используются те из них, которые допущены для введения в организм человека.

Уничтожение неиспользованных вакцин
Ампулы и другие емкости с неиспользованными остатками инактивированных бактериальных и вирусных вакцин, а также живой коревой, паротитной и краснушной вакцин, анатоксинов, иммуноглобулинов человека, гетерологичных сывороток, аллергенов, бактериофагов, эубиотиков, а также одноразовый инструментарий, который был использован для их введения не подлежит какой-либо специальной обработке.
Емкости, содержащие неиспользованные остатки других живых бактериальных и вирусных вакцин, а также инструментарий, использованный для их введения, подлежат кипячению в течение 60 минут (сибиреязвенная вакцина 2 ч), или обработке 3-5% раствором хлорамина в течение 1 ч, или 6% раствором перекиси водорода (срок хранения не более 7 сут) в течение 1 ч, или автоклавируются.
Все неиспользованные серии препаратов с истекшим сроком годности, а также не подлежащие применению по другим причинам следует направлять на уничтожение в районный (городской) центр санэпиднадзора.
Для получения вакцин используют штаммы патогенов, убитые или ослабленные, их субклеточные фрагменты или анатоксины.

Выделяют моновакцины вакцины, приготовленные из одного патогена, и поливакцины вакцины, приготовленные из нескольких патогенов и позволяющие развить стойкость к нескольким болезням.

6.
Сывороточные препараты также можно разделить на:

1. Нормальные сыворотки – получают из крови нескольких тысяч доноров и используют для профилактики респираторных инфекций у детей, для профилактики гепатита А, эпидемического паротита, кори, ветряной оспы. Они содержат кроме специфичных антител и большое кол-во других иммуноглобулинов.

2. Иммунные сыворотки – содержат иммуноглобулины направленного действия (антистафилококковый, против синегнойной палочки). Их получают путем очистки от неспецифических антител.

^ В настоящее время используются:

1. Иммуноглобулины человека: противогриппозный, противококлюшный, противодифтерийный, противостолбнячный, против клещевого энцефалита, против ветряной оспы, против гепатита А, противостафилококковый, противоботулинические.

2. Гетерологичные сыворотки и иммуноглобулины: противодифтерийная, противостолбнячная, противоботулиническая А, В, Е, противогангренозные – лошадиные, антирабический иммуноглобулин, противосибиреязвенный иммуноглобулин, пролученные из сыворотки лошадей, иммуноглобулин против клещевого энцефалита.

Активность иммунных сывороточных препаратов выражают в единицах, определяемых в серологических реакциях нейтрализации, агглютинации, преципитации и т.д. Профилактическое и лечебное действие оценивают в опытах на экспериментальных животных (белые мыши, кролики, морские свинки). Например, активность антитоксических сывороток выражают в международных антитоксических единицах (МЕ): 1 МЕ это количество антител, нейтрализующее определенное количество Dlm специфического токсина. Например, 1 МЕ противостолбнячной сыворотки это количество антитоксина, нейтрализующее 100 Dlm токсина для белой мыши. Противостолбнячная сыворотка обычно содержит 3000 МЕ/мл.

Иммунные сыворотки и иммуноглобулины создают пассивный специфический иммунитет практически сразу же после их введения. Этот иммунитет сохраняется при введении гомологичных сывороток до 1-1,5 мес и гетерологичных до 1020 сут (в организме чужеродные белки быстрее разрушаются). Иммунные сывороточные препараты вводят, как правило, внутримышечно в больших дозах и как можно раньше после вероятного инфицирования. Разработаны препараты и для внутривенного введения.

Биопрепараты для создания пассивного иммунитета. Лечебные сыворотки и иммуноглобулины. Принципы их получения.

Препараты для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний делятся на:

вакцины и анатоксины – для индукции специфического иммунного ответа с формированием активного противоинфекционного иммунитета за счет мобилизации механизмов иммунологической памяти;

иммунные сыворотки и Ig – содержат готовые специфические АТ (Ig), введение которых в O приводит к немедленному приобретению пассивного гуморального иммунитета, способного защитить организм от интоксикации или инфекции.

ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ И Ig

При многих инфекциях АТ играют защитную роль. Однако накопление достаточного количества антител наблюдается, как правило, не ранее чем через 2-3 нед после начала заболевания. Поэтому искусственное создание пассивного иммунитета показано при многих инфекциях как с целью серотерапии, так и с целью экстренной серопрофилактики (при непосредственной угрозе заболевания).

Иммунные сыворотки получают путем гипериммунизации лошадей, от которых можно получить сравнительно много крови, с последующей обработкой иммунной сыворотки (для концентрации АТ и очистки от балластных веществ методами ферментирования и диализа («Диаферм»)).

Силу антитоксических сывороток измеряют в международных единицах (ME) по способности нейтрализовать определенную дозу токсина.

Т.к. лошадиные сыворотки являются гетерологичными, они могут вызывать, особенно при повторном введении в организм, аллергические реакции на лошадиный белок ? обязательный предварительный контроль на чувствительность организма к лошадиному белку (внутрикожная проба с 0,1 мл лошадиной сывороткой в разведении 1:100). Введение допустимо только если нет выраженной кожной реакции в течение 20–30 мин.

Антитоксические иммунные сыворотки нужно вводить как можно раньше от момента заражения, так как АТ нейтрализуют токсин только до его адсорбции на клетке-«мишени».

Для уменьшения побочных эффектов из иммунных сывороток выделяют чистые Ig, также используют гомологичные человеческие сыворотки. Сырьем для приготовления нормального Ig человека может служить плазма крови доноров, сыворотка плацентарной крови. Использование Ig человека для экстренной профилактики и лечения кори, коклюша, менингококковой инфекции, полиомиелита, скарлатины обусловлено присутствием АТ против соответствующих возбудителей в крови взрослых людей, вследствие бытовой иммунизации, перенесенных инфекций или вакцинации против них.

От специально иммунизированных доноров получают сыворотку крови для приготовления Ig целенаправленного действия для экстренной профилактики и лечения столбняка, клещевого энцефалита, гриппа, стафилококковой инфекции. Противоэнцефалитный иммуноглобулин получают из сывороток крови людей, проживающих в местах распространения данного заболевания, содержащих достаточно высокий уровень специфических противовирусных АТ.

Для создания пассивного иммунитета очень перспективно получение препаратов моноклональных АТ на основе гибридом из клеток человека. Такие препараты будут обладать наиболее целенаправленным действием при минимальных возможностях осложнений.
15

Приложенные файлы

  • doc 280983
    Размер файла: 154 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий