Реакции организма — микроба


Агглютинацией называется обнаруживаемое невооруженным глазом склеивание и выпадение в осадок микробных тел при взаимодействии их со специфическими антителами — агглютининами. Видимая фаза агглютинации наступает в присутствии раствора электролита. Агглютинины содержатся в сыворотке крови человека и животных, перенесших инфекцию или искусственно иммунизированных соответствующим видом микроба.
Существуют различные модификации постановки реакции агглютинации.
Макроскопическая объемная агглютинация в пробирках (классический метод).
2. Ускоренная ориентировочная реакция агглютинации на предметном стекле
Цель: пробирочный метод используется для определения количественного содержания антител; пластинчатый метод является качественной реакцией и служит для предварительного определения вида микроба.
Используются как с диагностической целью (выявление антител в сыворотке крови), так и с целью идентификации (определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизма)
Постановка развёрнутой реакции агглютинации объёмным способом.
Для постановки реакции агглютинации требуются компоненты:
сыворотка крови, подлежащая исследованию, в количестве 0,1-0,2 мл;
изотонический раствор хлорида натрия;
3) корпускулярный антиген, взвесь живых или убитых бактерий (диагностикум).
Приготовление разведений сыворотки больного. Из исследуемой сыворотки готовят ряд последовательных двукратных разведений, чаще всего от 1:50-1:100 до 1:1600-1:3200. В отдельной пробирке готовят первое, основное, разведение сыворотки, обычно 1:50 или 1:100. Основное разведение сыворотки используют для приготовления ряда последовательных разведений.
Две последние пробирки ряда предназначены для контроля антигена и сыворотки (КА - контроль антигена и КС - контроль сыворотки)
Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается агглютинация, считают ее титром.
Условия: строгое участие и подбор всех компонентов
Во все пробирки, за исключением первой и последней (КС), наливают по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. Затем из пробирки с основным разведением сыворотки (например, 1: 100) берут З мл и наливают по 1мл в 1-ю, 2-ю и в последнюю пробирку (КС). Далее 1 мл содержимого 2-й пробирки переносят в 3-ю, из 3-й пробирки такое же количество - в 4-ю, из 4-й - в 5-ю. Из 5-й пробирки (последняя опытная) 1мл содержимого выливают в банку с дезинфицирующим раствором для сохранения одинакового объема (1мл) во всех пробирках.
Таким образом, разведение сыворотки в первой пробирке соответствует основному ее разведению (1:100); в последующих пробирках получается ряд последовательных двукратных разведений: 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600.
По окончании разведений во все пробирки ряда, за исключением КС, прибавляют по 1-3 капли антигена, содержащего 2 млрд. живых или убитых микробных тел в 1 мл. После этого жидкость в пробирках становится слегка мутноватой.
После добавления антигена к разведенной сыворотке штатив с пробирками встряхивают для лучшего перемешивания сыворотки с изотоническим раствором хлорида натрия, ставят на 2 ч в термостат при 37 °С, а затем учитывают предварительный результат реакции. Окончательный результат регистрируют через 18-20 ч. Нахождения пробирок при комнатной температуре. Положительный результат реакции агглютинации характеризуется образованием на дне пробирки осадка с выраженным просветлением надосадочной жидкости. Остаток на дне пробирки, образовавшийся, в результате склеивания микробных тел, называется агглютинатом.
Механизм реакции основан на взаимодействии детерминантных групп антигена с активными центрами иммуноглобулина в электролитной среде. Реакции протекают в две фазы - соединение антигена с антителом, вторая фаза - выделение в осадок образовавшегося комплекса АГ+АТ. Характер осадка зависит от природы антигена: жгутиковые бактерии дают крупнохлопьевый осадок, безжгутиковые и бескапсулярные - мелкозернистый, капсульные – тяжистый.
Учет результатов реакции агглютинации начинают с просмотра контрольных пробирок. Реакция может считаться положительной лишь в том случае, если в пробирках с контролями жидкость остается совершенно однородной, в КА - слегка мутной, в КС - прозрачной.
Для регистрации результатов реакции агглютинации пользуются четырехкрестной системой обозначения:
+ + + + полная агглютинация, при которой большой осадок на дне располагается кучкой или в форме открытого перевернутого зонтика, надосадочная жидкость в пробирке совершенно прозрачна,
+ + +почти полная агглютинация, осадок такой же, как
в предыдущем случае, жидкость почти прозрачная,
+ +слабая агглютинация, небольшой осадок, жидкость непрозрачная
+отмечают следы агглютинации, осадок едва заметен, жидкость непрозрачная,
—отрицательная реакция, содержимое пробирок равномерно мутное, без осадка, по виду неотличимо от содержимого пробирки КА.
Реакцию агглютинации используют для определения антител в сыворотке крови больных, например при брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля), бруцеллезе (реакции Райта, Хеддлсона), туляремии и других инфекционных болезнях, а также для определения возбудителя, выделенного от больного. Эта же реакция применяется для определения групп крови.
Определение серологического типа выделенного микроба.
Серологическая идентификация микроба посредством агглютинации соответствующей специфической сывороткой является завершающим этапом в проведении идентификации микробных культур (серологическое типирование).
Ориентировочная (пластинчатая) реакция агглютинация. Пластинчатой реакцией агглютинации на предметном стекле часто пользуются для определения вида микроба. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят с помощью пастеровской пипетки 2 капли агглютинирующей сыворотки и 1 каплю изотонического раствора хлорида натрия. Капли располагают на некотором расстоянии друг от друга, чтобы исключить возможность их слияния. Затем в каплю изотонического раствора хлорида натрия (КА) и в одну из капель агглютинирующей сыворотки вносят исследуемую бактериальную культуру, снятую с поверхности плотной питательной среды. Ко второй капле (КС) культуру не добавляют. Внесенную культуру тщательно перемешивают, чтобы капля жидкости сделалась равномерно мутной. Реакция протекает при комнатной температуре. Результат учитывают с помощью лупы через 5—10 мин. При положительной реакции в капле с сывороткой отмечается склеивание бактерий в виде зернышек или хлопьев, хорошо видимых при покачивании стекла.
Реакция агглютинации для определения групп крови и резус-фактора. Антитела к резус-фактору эритроцитов являются неполными, поэтому, связываясь с эритроцитами, эти антитела не могут их агглютинировать. Для их выявления дополнительно в реакцию вводят антиглобулиновую сыворотку, содержащую антитела к иммуноглобулинам человека (реакция Кумбса). Антитела антиглобулиновой сыворотки, взаимодействуя с неполными антителами к резус-фактору, адсорбированными на эритроцитах, агглютинируют эритроциты. С помощью реакции Кумбса выявляют как антитела против резус-фактора, так и резус-фактор; диагностируют гемолитическую болезнь новорожденных, эритроциты которых соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору.
РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА)
Для постановки РНГА требуются:
Сыворотка, подлежащая исследованию.
Растворимый антиген для сенсибилизации эритроцитов.
Эритроциты.
Изотонический раствор хлорида натрия.
Реакцию непрямой гемагглютинации ставят в пластинках из органического стекла с лунками.
Постановка реакции. Из исследуемой сыворотки готовят ряд последовательных разведений. Приготовленные разведения сыворотки разливают в лунки по 0,5 мл. К каждому разведению исследуемой сыворотки прибавляют от 0,1 до 0,5 мл 0,5-1% взвеси; сенсибилизированных эритроцитов. Каждый опыт сопровождается постановкой контролен на отсутствие спонтанной агглютинации (1 и 2) и контролем на специфичность реакции (3 и 4):
0,5мл изотонического раствора хлорида натрия + рабочая доза сенсибилизированных эритроцитов.
0,5мл изотонического раствора хлорида натрия + рабочая доза несенсибилизированных эритроцитов.
3. Иммунная сыворотка, взятая в разведении, соответствующем ее титру (последнее разведение, дающее положительную реакцию в РНГА), Нерабочая доза сенсибилизированных эритроцитов.
4. Нормальная сыворотка, не содержащая специфических антител, + рабочая доза сенсибилизированных эритроцитов
Сущность непрямой, или пассивной, реакции гемагглютинации (РНГА) заключается в том, что эритроциты, обладая способностью адсорбировать на себе антигены, становятся «чувствительными» (сенсибилизированными) к соответствующей иммунной сыворотке. Под воздействием специфических антител сенсибилизированные эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне пробирки гемагглютинат. Отличаясь высокой чувствительностью и специфичностью, РНГА позволяет обнаруживать минимальные количества антител и неполноценные антигены полисахаридной природы. Результат реакции агглютинации учитывают после осаждения эритроцитов в контрольных пробирках непосредственно после инкубации в термостате при температуре 37 °С или после дополнительного выдерживания при комнатной температуре в течение 18-24 ч. Результаты оценивают по внешнему виду осадка эритроцитов в лунках. В положительном случае, обозначаемом знаком +, эритроциты равномерно в виде «зонтика» покрывают почти все дно пробирки или лунки. При отрицательном результате эритроциты оседают в зависимости от дна пробирки в форме компактного комочка, «пуговки». Реакцию применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам.
ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Иммуноэлектрофорез позволяет разделять сложные смеси антигенов, например антигены, содержащиеся в сыворотке крови.
Разделение осуществляют в агаровом геле, помещенном в электрическое поле, причем рН геля устанавливают так, чтобы положительно заряженные белки перемещались к катоду, а отрицательно заряженные - к аноду.
Между лунками вырезают канавку, которую заполняют раствором антител, диффундирующих в гель.
3.Антигены и антитела формируют дуги преципитации.
Реакция проводится в два этапа: вначале проводят электро-форетическое разделение смеси белков. По окончании электрофореза в канавку вносят антисыворотку. Антиген и антисыворотка диффундируют навстречу друг другу, образуя дугообразные линии преципитации. Количество, форма, положение этих линий характеризуют антигенный состав исходного биоматериала (в данном случае сыворотки).
Сущность: заключается во взаимодействии мелкодисперсных антигенов с соответствующими антителами и образование преципитата
Иммунодиффузия продолжается не менее 24 ч при указанной в методике силе тока. После иммунодиффузии пластины высушивают, окрашивают и интерпретируют результаты.
Чувствительность метода - более 100 мкг/мл.
Специфичность метода зависит от чистоты антисыворотки (поликлональная, моноклональная). Качество исследования повышается при использовании полностью автоматизированных систем.
Иммуноэлектрофорез широко распространен в лабораторной практике для исследования белков сыворотки, СМЖ, мочи, экстрактов из органов. Наибольшее значение имеет при диагностике парапротеинемий и иммунодефицитных состояний. Метод широко используется для характеристики чистоты препаратов в фармацевтической промышленности, производстве вакцин, применяется для определения активности антитоксической сыворотки.
Встречный электрофорез проводят в агаровом геле, рН которого устанавливают так, чтобы антитела (Ат) несли суммарный отрицательный заряд, а исследуемый антиген (Аг) - положительный. В электрическом поле антиген и антитела движутся навстречу друг другу и преципитируют. Принцип метода тот же самый, что и при двойной иммунодиффузии, однако чувствительность выше в 10-20 раз.
Ракетный электрофорез позволяет количественно определять антиген в антителосодержащем геле, рН которого подбирают с расчетом, чтобы движения антител не происходило, а антиген нес суммарный отрицательный заряд. Линия преципитации очерчивает область в виде ракеты, длина которой пропорциональна концентрации антигена. Определить эту концентрацию можно по калибровочной кривой. Оба метода основаны на различаи суммарных зарядов антигена и антител при выбранном pH.
РАДИОИММУННЫЙ АНАЛИЗ (РИА)
Радиоиммунный анализ (РИА)
Радиоиммунный метод применяется с целью количественного определения различных веществ - гормонов, белков сыворотки крови, микробных антигенов.
Метод позволяет выявить незначительные количества антигена. При радиоиммуноанализе необходимо строгое соблюдение правил работы с изотопами (защита, условия труда, утилизация отходов).
Жидкостный радиоиммунный анализ
Очищенный известный антиген метят радионуклидами. При конкурентном варианте связывания для определения количества антигена в исследуемом образце определяют его способность конкурировать с меченым референс-антигеном в связывании со специфическими антителами, образуются иммунные комплексы антиген-антитело, которые осаждают сульфатом аммония или антиантителами, определяют радиоактивность, сравнивают с радиоактивностью несвязавшегося антигена. С помощью стандартной калибровочной кривой устанавливают концентрацию исследуемого антигена.
Твердофазный радиоиммунный анализ
Специфические антитела фиксируются на твёрдой фазе, добавляют исследуемый антиген и меченый стандартный антиген. Определяют радиоактивность связанного и несвязанного антигена и по стандартной калибровочной кривой устанавливают концентрацию исследуемого антигена.
РЕАКЦИЯ КОАГГЛЮТИНАЦИИ (РКОА)
Реакция используется в микробиологической практике для индикации и типирования корпускулярных и растворимых антигенов. Преимущества реакции - специфичность, простота постановки, экономичность.
Сущность реакции - белок А, находящийся на поверхности золотистого стафилококка (штамма Cowan 1), селективно реагирует с Fc - фрагментом Igl, Ig2, Ig4, в результате чего остаются свободными антидетерминанты антител (Fab - фрагмент), которые взаимодействуют с гомологичными антигенами и вызывают агглютинацию стафилококков. Компоненты реакции:
коммерческие стафилококковые реагенты;растворимый антиген или исследуемая культура; Постановка реакции:
Реакция ставится на пластинах или предметных стеклах. К стафилококковому реагенту добавляют 0,1 мл исследуемой культуры или растворимого антигена, осуществляют инкубирование при комнатной температуре в течение 10-30 мин. В положительном случае отмечается образование агглютинации в капле.
РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ
Реакция преципитации является качественным методом исследования, при котором диагностическое значение имеет появление осадка в реагирующих жидкостях.
Для обозначения антигенов, участвующих в реакции преципитации, принят термин «преципитиноген», для антител - «преципитин», для специфического осадка, образующего в результате реакции - «преципитат». Преципитат, возникающий вследствие укрупнения коллоидных частиц антигена, может иметь вид кольца, формирующегося на границе антигена с иммунной сывороткой.
Для постановки реакции преципитации необходимы:
Сыворотки (исследуемые или иммунные - преципитирующие).
Антигены (исследуемые или диагностические).
Изотонический раствор хлорида натрия рН 7,0-7,2.
Пастеровские пипетки.
Преципитационные пробирки (диаметром 2-3 мм и высотой 2-3 см для реакции кольцепреципитации, диаметром 4 мм и высотой 4-6 см для реакции преципитации по типу флокуляции). В узких пробирках реакция преципитации наступает значительно скорее и проявляется более четко, чем в пробирках большого диаметра.
Реакцию преципитации используют в следующих целях:
1) для выявления специфических антител в исследуемой сыворотке на основе применения определенных антигенов;
2) для обнаружения антигенов белковой или полисахаридной природы с использованием известной, специфической, пре-ципитирующей сыворотки.
Условия: Участвующие в реакции ингредиенты должны быть совершенно прозрачны. Для этого их центрифугируют или фильтруют через бактериальный фильтр; При постановке реакции преципитации в отличие от реакций агглютинации титр преципитирующих сывороток определяют по наибольшему разведению, антигена, при котором еще наблюдается образование преципитата;
Сущность: заключается во взаимодействии мелкодисперсных антигенов с соответствующими антителами и образование преципитата.
Техника постановки реакции преципитации. 1. В штатив устанавливают два ряда преципитационных пробирок. В пробирках первого ряда готовят
несколько последовательных разведений антигена (степень начального и конечного, разведений определяется способом приготовления и активностью
антигена). Экстракты микробных культур разводят обычно от 2 до 64 раз.
«Полный» антиген Буавена, представляющий собой комплекс полисахаридов и липоидов, извлеченных из тела микробной клетки, разводят в десятки и
сотни тысяч раз.
В каждую пробирку второго параллельного ряда вносят 0,5 мл цельной или разведенной 1:2 преципитирующей сыворотки. Затем разведенный антиген,
находящийся в пробирках первого ряда, переносят в объеме 0,5 мл в соответствующие пробирки второго ряда.
Для предупреждения возможных ошибок при оценке результатов реакции рекомендуется ставить следующие контроли:
нормальная сыворотка от животного того же вида, которого иммунизировали для получения преципитирующей сыворотки + исследуемый антиген;
специфическая преципитирующая сыворотка + изотонический раствор хлорида натрия;
специфическая преципитирующая сыворотка + заведомо соответствующий, ей антиген.
Смесь антигена с сывороткой после тщательного перемешивания ставят на 2 ч в термостат, а затем на 18-20 ч оставляют при комнатной температуре. В случае положительного результата в прозрачной жидкости образуются хлопья преципитата, оседающие в виде рыхлого осадка на дно пробирки. Предельное разведение антигена, с которым сыворотка образует преципитат, считается титром сыворотки.
При постановке реакции кольцепреципитации в ряд узких пробирок вносят с помощью пастеровской пипетки по 0,1-0,2 мл сыворотки так, чтобы не смочить ею внутреннюю поверхность стенок пробирки. Затем на поверхность сыворотки наслаивают различные разведения антигена в количестве, равном объему сыворотки, содержащейся в пробирке.
Чтобы не произошло смешивания жидкостей, пробирку в момент наслаивания антигена держат в наклонном положении, а антиген отдельными каплями наливают по внутренней поверхности стенки, пользуясь для этой цели пастеровской пипеткой с длинным, очень тонким капилляром. В результате правильного наслоения антигена в пробирке образуются два четко отграниченных, не смешивающихся при стоянии слоя. Реакция кольцепреципитации сопровождается постановкой трех обязательных контролей. После добавления антигена пробирки помещают в штатив и оставляют при комнатной температуре. При положительной реакции преципитации, в течение 5-30 мин на границе соприкосновения двух жидкостей появляется хорошо видимое на темном фоне кольцо молочно-белого цвета. В контрольных пробирках, за исключением 3-й (специфическая преципитирующая сыворотка + соответствующий ей антиген), кольца помутнения не появляются. Данную реакцию применяют для выявления антигенов с помощью иммунной преципитирующей сыворотки, содержащей специфические антитела.
Реакция преципитации в агаре.
Реакция преципитации в агаре (предложенная Уденом и разработанная Аухтерлони) используется для изучения состава сложных антигенных смесей, обнаружения состава сложных общих антигенов микроорганизмов, для контроля степени очистки биологических препаратов.
Антиген и антитела (имеющие различную дисперсность) за определенный промежуток времени проходят в агаре различные расстояния, создавая при этом постепенно убывающие концентрации. При встрече соответствующих антигенов и антител в зоне оптимальных концентраций образуются видимые простым глазом белые линии преципитата. Антиген, вступая во взаимо действие с гомологичным антителом, образует только одну линию преципитата, при участии в реакции нескольких антигенов и антител каждая система ведет себя независимо друг от друга, число образующихся зон преципитации равно или меньше количества присутствующих в растворе систем антиген - антитело.
Реакция преципитации, представляет собой метод качественного анализа и позволяет изучать антигенный состав бактериальных препаратов.
Различают следующие методы постановки реакции преципитации
а) метод простой диффузии, при котором одно реагирующее вещество (обычно антиген) диффундирует в агар, содержащий постоянную концентрацию другого реагирующего вещества, - иммунную сыворотку;
б) метод двойной диффузии, при котором антиген и антитело, движутся навстречу друг другу через нейтральный слой агара.Метод простой диффузии. Агар, приготовленный для постановки реакции преципитации, растапливают в водяной бане. К расплавленной и охлажденной до температуры 45-50°С среде приливают равное количество преципитирующей сыворотки, смесь осторожно перемешивают, и разливают в чашки Петри.
После застывания агара устанавливают матриксы в количестве, соответствующем числу исследуемых антигенов, наливают еще один слой агара высотой 3-4 мм. После застывания которого матриксы вынимают. Образующиеся лунки в среде заполняют исследуемыми антигенами и чашки на 3-5 час. оставляют при комнатной температуре, а затем сохраняют в холодильнике при 3° С в течение 10-14 дней.
При положительном результате реакции на 7-10-й день после постановки опыта появляются зоны преципитации мутно-белого цвета в форме концентрических окружностей, расположенных вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют, в частности, для определения содержания в крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента
Метод двойной диффузии. В стерильные чашки Петри наливают 2% агар без добавления сыворотки, устанавливают матриксы и наливают второй слой среды.
Одну лунку заполняют преципитирующеи сывороткой, в другую вносят антиген. Чашки хранят при комнатной температуре или в холодильнике в течение 2 нед. Растворимые антигены и сыворотка диффундируют в окружающий агар во всех направлениях.
При положительном результате реакции по линии контакта между двумя диффундирующими веществами происходит реакция преципитации, внешним проявлением которой служит возникновение между лунками, заполненными сывороткой и антигеном, поперечной полоски молочно-белого цвета.
При использовании в опыте сложных антигенных смесей в агаре, разделяющем лунки, образуется спектр линий. Число линий соответствует числу пар антиген – антитело. Реакцию Аухтерлони можно использовать для определения токсичности бактерий, титра антител, активности стандартных диагностикумов или иммунных специфических сывороток
Радиальная иммунодиффузия по МанчиниРадиальная иммунодиффузия по Манчини позволяет использовать моноспецифические антисыворотки и эталон с известным содержанием антигена. Тест-антиген и разведения растворов, исследуемых на наличие данного антигена, помещают в лунки, вырезанные рядами в пластине геля, куда предварительно внесена соответствующая моноспецифическая антисыворотка Антиген диффундирует в гель и, соединившись со специфическими антителами, формирует кольца преципитации, диаметры которых зависят от концентрации антигена в лунках. Полученные результаты используют для построения калибровочной кривой, выражающей зависимость диаметров преципитантов от концентрации антигена в исследуемых растворах. Принцип радиальной диффузии положен в основу метода, применяемого для изучения токсигенности бактериальных культур и отбора из бактериальной популяции КЛОНОВ С ВЫСОКОЙ степенью токсичности. В этом случае исследуемые культуры засевают в чашки с агаром, содержащим антитоксическую сыворотку. Вокруг отдельных колоний образуются кольца преципитации, диаметр которых прямо пропорционален степени токсичности штамма.
РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА
Ингредиенты: Сыворотка больного 1:5 25мл.; Антиген в рабочей дозе (диагностикум) 25мл.; комплемент 25мл.; «+» иммунная сыворотка для пол.контроля 25мл.; «-« сыворотка для отрицательного контроля; физ.р-р 25мл.; гемолитическая система (эритроциты барана, иммунная сыворотка содержащая антитела к этим эритроцитам) 50мл.; все компоненты титруются
Условия: строгое участие и подбор всех компонентов; поочередное внесение ингредиентов; физ.р-р.; использование «+» м качеств.реакцииКомплемент в рабочей дозе берется в 3 раза <, чем определяемый титр комплемента.
После внесения антигена к сыворотке комплемента 37 °С на 1 час. Реакция ставится в парных сыворотках через 10 и 20 дней, после начала заболевания. Сущность: АГ+АТ+КОМПЛИМЕНТ.
Реакция протекает в две фазы с участием двух систем: бактериальной и гемолитической.
В первой реакции (специфической) участвуют антиген + антитело + комплемент. Положительный результат реакции, наступающий при соответствии антител антигену, характеризуется образованием специфического бактериального комплекса антиген - антитело с адсорбированным, или, как говорят, «связанным», комплементом. Оставаясь невидимым, комплекс не вызывает никаких внешних изменений той среды, в которой он образовался.
Отрицательный результат РСК имеет место при отсутствии специфического сродства между антигеном и антителом сыворотки и характеризуется сохранением свободного активного комплемента.
Первая фаза РСК может проводиться в термостате при 37°С (1-2 ч) или в холодильнике при 3-4°С (18-20 ч).
При длительном образовании иммунного комплекса антиген - антитело на холоде происходит более полное связывание комплемента и вследствие этого чувствительность реакции увеличивается.
Вторая фаза реакции (индикаторная) происходит между реагентами гемолитической системы (смесь 3% взвеси эритроцитов и гемолитической сыворотки в равных объемах) при температуре 37 °С только при наличии комплемента, оставшегося свободным от первой фазы реакции (реакция отрицательная).
При отсутствии свободного активного комплемента гемолиза эритроцитов под действием специфических гемолизинов не наступает (реакция положительная).
Реакцию связывания комплемента можно применять для следующих целей:
выявления специфических антител в неизвестной сыворотке на основании взаимодействия их с антигеном известной природы;
2) изучения свойств антигена в реакции с известной специфической сывороткой
PCK используется для лабораторной диагностики венерических заболеваний, риккетсиозов, вирусных инфекций (грипп, корь, клещевой энцефалит и др.) и основывается на способности комплемента связываться с комплексом АГ + AT. Комплемент адсорбируется fс-фрагменте иммуноглобулинов G и М. Реакция протекает в две фазы. Первая фаза - взаимодействие антигена и антитела. В качестве материала, содержащего антитела, используется исследуемая сыворотка, к которой добавляется известный антиген. К этой системе добавляют стандартный комплемент и инкубируют при 37°С в течение одного часа.
Вторая фаза - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка кролика, содержащая гемолизины к эритроцитам барана). К смеси антиген + антитело + комплемент (1-я фаза) добавляют индикаторную систему и вновь инкубируют при 37°С в течение 30 - 60 мин, после чего оценивают результаты реакции. Разрушение эритроцитов происходит в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. Если комплемент адсорбировался ранее на комплексе АГ + AT, то гемолиз эритроцитов не наступает. Гемолиз происходит в том случае, когда в исследуемой сыворотке содержатся специфические антитела к диагностическому антигену. При отсутствии в исследуемой сыворотке специфических антител, комплекс АГ + AT не образуется и комплемент остается несвязанным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и происходит гемолиз эритроцитов. Интенсивность РСК оценивают по ЧеТЫреХКреСТНОЙ СИСТеме В ЗаВИСИМОСТИ ОТ степени Задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов.
Оценка интенсивности реакции:
+ + + + полная задержка гемолиза, жидкость бесцветна, значительный осадок эритроцитов
+ + +ясная задержка гемолиза, жидкость бледно-розового цвета, значительный осадок эритроцитов
+ +частичная задержка гемолиза, жидкость интенсивно окрашена, довольно компактный осадок эритроцитов
+слабая задержка, жидкость интенсивно окрашена,
осадок эритроцитов небольшой
±следы задержки, почти полный гемолиз, осадок в виде облачка полный гемолиз, «лаковая» кровь, отсутствие осадка
Способность комплемента лизировать клетки, несущие на поверхности антитела, в присутствии антигена используется в различных реакциях для определения антител, клеток, синтезирующих специфические антитела, уровень комплемента.
РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ
Реакцию вирусной гемагглютинации ставят на предметных стёклах, в пробирках, в лунках полистероловых планшетов. Компоненты реакции - вируссодержащий материал (аллантоисная и амниотическая жидкости), 1% взвесь эритроцитов к исследуемому вирусу. Постановка реакции на стекле: перечисленные компоненты смешивают и через 1-2 мин отмечают результат реакции. При положительном результате регистрируют появление хлопьевидного осадка, агглютинацию эритроцитов.
Постановка реакции в пробирках:
Готовят ряд двукратных разведений вируссодержащего материала с помощью изотонического раствора хлорида натрия (1:2,1:4, 1:8,1:32, 1:64), во все пробирки вносят 1% взвесь эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют при 37, 22 или 4°С в зависимости от свойств вируса. Регистрация реакции проводится после оседания эритроцитов в контроле. В положительном случае степень агглютинации эритроцитов отмечают плюсами (оценка по 4х-крестовой системе). При чёткой реакции ++++ образуется плёнка из склеенных эритроцитов на дне пробирки (зонтик). Устанавливают титр реакции, за титр принимают предельное разведение вируссодержащего материала, которое вызвало агглютинацию эритроцитов на ++. Указанное разведение содержит одну гемагглютинирующую единицу вируса (1АБ).
Видовую принадлежность вирусов устанавливают' с помощью РТГА (реакции торможения гемагглютинации).
РТГА, Сущность реакции: При взаимодействии вирусных антигенов (гемагтлютининов) и специфических антител происходит образование иммунного комплекса антиген-антитело, торможение гемагглютинации.
С помощью данной реакции возможно проведение видовой идентификации вирусов и осуществление серологической диагностики вирусных инфекционных заболеваний. При постановке ориентировочной реакции торможения гемагглютинации (РТГА) на стекле на чистые обеззараженные предметные стекла наносят на некотором расстоянии друг от друга по одной капле типоспецифических иммунных и нормальной сывороток. Затем к ним добавляют по одной капле испытуемого материала и 5% взвеси эритроцитов. Компоненты перемешивают и учитывают результаты после появления хлопьевидного осадка в смеси, содержащей нормальную сыворотку.
Иммунная сыворотка, специфическая для выделенного вируса, подавляет его гемагглютинирующую активность, и эритроциты не агглютинируются.
РТГА с целью проведения серологической диагностики
При использовании РТГА с целью проведения серологической диагностики вирусных инфекционных заболеваний, берут парные сыворотки пациента, первую сыворотку получают в начале заболевания, вторую - спустя 2 недели и более.
Диагностическое значение имеет возрастание титра антител в 4 раза и более, что свидетельствует о положительной серологической диагностике вирусного инфекционного заболевания.
Для проведения серологической диагностики в РТГА в лунках планшета готовят двукратные разведения исследуемых сывороток пациента в изотоническом растворе хлорида натрия по 0,25 мл. Предварительно определяют титр вирусного антигена в реакции гемагглютинации с целью выбора рабочей дозы. Рабочее разведение берут в 16 раз меньше титра. К разведениям сыворотки добавляют по 0,25 мл рабочего разведения антигена, инкубируют 2 часа при температуре 37°С и добавляют по 0,5 мл 1% взвеси куриных эритроцитов. После инкубирования в течение 2 часов регистрируют результат реакции. В положительном случае на дне лунки образуется плотный осадок эритроцитов в виде диска с ровными краями. Устанавливают титр антител по последнему разведению сыворотки при котором отмечается положительный: результат реакции, подавляется гемагглютини-рунлная активность антигена.
В РТГА ставят три контроля: I) контроль эритроцитов (0,5мл изотонического раствора хлорида натрия +0,5 мл использованной взвеси эритроцитов; 2) контроль используемой сыворотки на способность агглютинировать эритроциты (0,25 мл исходного разведения сыворотки + 0,25 мл изотонического раствора хлорида натрия +0,5 мл взвеси эритроцитов); 3) контроль специфичности антигена (при ретроспективной диагностике инфекций) со стандартной иммунной сывороткой (0,25 мл иммунной сыворотки в разведении 1:10 + 0,25 мл рабочего разведения антигена + 0,5 мл взвеси эритроцитов. Широко применяется для диагностики вирусных инфекций с целью обнаружения специфических антител и для идентификации многих вирусов по их антигенам.
РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ
Используются как с диагностической целью (выявление антител в сыворотке крови), так и с целью идентификации (определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизма)
В реакции нейтрализации участвуют 3 компонента:
Вирус;
Сыворотка, содержащая антитела;
Биологический объект
Постановка реакции нейтрализации на лабораторных животных
Пробирки расставляют в штативы параллельными рядами так, чтобы количество пробирок в каждом ряду соответствовало числу используемых в опыте разведении вируса (последнее должно превышать биологический титр вируса), а количество рядов — числу взятых сывороток и контролен. Для контроля в один ряд пробирок наливают нормальную сыворотку, в другой — изотонический раствор хлорида натрия (контроль активности вируса). Ингредиенты вносят в пробирки в объеме 0,5 мл. Сыворотки используют неразведёнными или в разведении 1:5. Готовят разведения вирусной суспензии, которые вносят в пробирки, содержащие в равном объеме специфические сыворотки, нормальную сыворотку или изотонический раствор хлорида натрия. Смеси встряхивают, выдерживают в течение 1—2 часа при температуре термостата, комнатной температуре или 18—20 ч при 4°С и вводят для индикации инфекционного вируса лабораторным животным. Каждой смесью в равном объеме заражают по 4—6 лабораторных животных.
Критерием наличия инфекционного вируса в смеси служит гибель лабораторных животных. При оценке результатов высчитывают по методу Рида-Менча предельное разведение вирусной суспензии, которое вызвало гибель 50% зараженных животных. Для каждой взятой в опыт иммунной сыворотки высчитывают индекс нейтрализации, т. е. максимальное количество летальных доз вируса, нейтрализованное данной иммунной сывороткой по сравнению с контрольной сывороткой. Тип вируса устанавливают по типоспецифической сыворотке, которая показала наивысший индекс нейтрализации.
Постановка реакции нейтрализации в развивающихся куриных эмбрионах
Критерием наличия инфекционного вируса в смеси его с сывороткой при использовании в качестве индикаторной системы куриных эмбрионов является выявление морфологических изменений на хорион-аллантоисных оболочках или гемагглютинина в аллантоисной жидкости эмбрионов. При оценке результатов по методу Рида-Менча для куриных эмбрионов определяют — одну ИД5о.
Реакция нейтрализации по методу цветной пробы.
Цветная проба основана на способности вирусов изменять метаболическую активность зараженных клеток, что определяют по цвету индикатора, содержащегося в среде. В незараженных культурах клеток под влиянием выделяющихся продуктов клеточного метаболизма рН среды сдвигается в кислую сторону, вызывая изменение цвета фенолового красного. В зараженных культурах в результате дегенерации клеток их метаболическая активность подавляется, и цвет фенолового красного не изменяется или изменяется частично. Специфические иммунные сыворотки, нейтрализуя вирус, предотвращают угнетение метаболизма клеток.
Сущность реакции вирусной нейтрализации в культуре клеток.
Специфические антитела прочно соединяются с вирусной частицей, в результате взаимодействия между вирусом и антителом происходит нейтрализация инфекционной активности вируса вследствие блокады антигенных детерминант, ответственных за соединение вирусной частицы с чувствительными клетками. В результате указанного взаимодействия вирус утрачивает способность размножаться в чувствительной к нему биосистеме. В качестве чувствительной биосистемы могут выступать культура клеток, куриный эмбрион, организм чувствительного лабораторного животного.
Перед постановкой реакции готовят вируссодержащую суспензию из выделенного возбудителя или из известного лабораторного штамма {при проведении титрования сывороток). В зависимости от вида вируса его выращивают в культуре ткани, в органах лабораторных животных, в курином эмбрионе. Для реакции нейтрализации пользуются культуральные жидкости, суспензии органов лабораторных животных, аллантоисную и амниотиче-скую жидкости куриных эмбрионов.
В зависимости от целей исследования реакция вирусной нейтрализации может ставиться в 2 направлениях:
для идентификации вируса.
для проведения серологической диагностики вирусных инфекционных заболеваний.
Перед постановкой каждого нейтрализационного опыта вирус предварительно титруют, определяя его конечное разведение, вызывающее повреждение культуры ткани или инфицирование лабораторных животных, куриных эмбрионов.
Методика подготовки реакции.
Клетки выращивают обычным способом в матрацах до образования сплошного монослоя. Затем их снимают со стекла версе-ном, осаждают центрифугированием при 1000 об/мин 5—10 мин, ресуспендируют в питательной среде, контролируют на стерильность
Титрование вирусов в цветной реакции. Готовят 10-кратные разведения вирусной суспензии на питательной среде, содержащей 2% бычьей сыворотки. Каждое разведение вируса вносят в объеме 0,25 мл в 2 пробирки. К ним добавляют по одной дозе клеток в объеме 0,25 мл, 0,25 мл питательной среды и 0,6—0,8 мл вазелинового масла.
В пробирках, содержащих вирус, клетки дегенерируют и цвет среды не изменяется или меняется лишь частично: остается красным или оранжевым. Желтый цвет среды в пробирках свидетельствует об отсутствии вируса и наличии живых клеток.
Результаты реакции оценивают по методу Рида — Менча, устанавливая то наибольшее разведение вирусной суспензии, которое подавило метаболизм в 50% зараженных пробирок (среда сохранила красный или оранжевый цвет), и принимая его за одну ЦПД5о.
Реакция нейтрализации для идентификации вируса
Различные разведения вируссодержащего материала смешивают с неразведённой противовирусной сывороткой. Смесь компонентов инкубируют в термостате при температуре 37 0С в течение 1-2 часов или при температуре 4°С в течение 18 часов. Смесью вируса и сыворотки заражают культуру клеток. При регистрации реакции определяют нейтрализующий эффект антител сыворотки по отсутствию цитопатического действия вируса на клетки. Тип выделенного вируса соответствует типу иммунной сыворотки, предупредившей развитие специфической дегенерации клеток.
Титрование антител в цветной реакции.
При проведении серологической диагностики вирусных инфекций с помощью реакции нейтрализации определяют динамику нарастания титра вируснейтрализующих антител по известному вирусу. Для этого пользуются парными сыворотками, взятыми от больного в разные сроки - в начале и в конце заболевания, диагностическое значение имеет 4 кратное и более возрастание титра антител, регистрируемое в ходе заболевания.
Готовят двукратно возрастающие разведения используемой сыворотки, каждое из которых в объеме 0,25 мл вносят в пробирки параллельных рядов, количество которых соответствует числу взятых в опыт серологических типов вирусов. Во все пробирки добавляют по 0,25 мл вирусной суспензии, содержащей 100 ЦПД5о. Смеси инкубируют 1 ч при комнатной температуре, добавляют по 0,25 мл суспензии клеток, термостатируют при 37°С. Опыт сопровождают тремя контролями: 1) контроль клеток; 2) контроль токсичности используемой сыворотки; 3) контроль дозы вируса
Пробирки инкубируют в термостате в течение 6—7 дней и оценивают результаты, ориентируясь на состояние контролен клеточных суспензий.
В пробирках, содержащих полиостью нейтрализованный антителами вирус, метаболизм клеток не нарушается и цвет среды становится желтым. При частичной нейтрализации вируса антителами часть клеток остается живой, и среда приобретает оранжевый цвет. При отсутствии антител вирус вызывает дегенерацию клеток, метаболическая активность их подавляется и среда остается красной.
За титр антител принимают то предельное разведение сыворотки, которое нейтрализует действие 100 ЦПД50 вируса и предотвращает угнетение метаболической активности клеток (желтый цвет среды).
ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД
Реакция иммунофлюоресценции — РИФ (метод Кунса) основана на том, что антигены тканей или микроорганизмы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа (прямой метод). Бактерии в мазке, обработанные такой специфической сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. Различают три основные разновидности метода: прямой, непрямой, непрямой с комплементом.
Иммунофлюоресцентный метод чаще применяется для качественной характеристики биоматериала с целью обнаружения конкретного микроорганизма, конкретной клетки. Метод имму-нофлюоресценщш может проводиться в прямом и непрямом вариантах. Для обнаружения искомого вещества используется люминесцентный микроскоп.
В качестве флюоресцентной метки используют красители: изотиоцианат (сине-зеленый), родаминсульфохлорид (оранжево-красный) и др.
При прямом флюоресцентном методе Кунса специфические флюоресцирующие антитела взаимодействуют с гомологичными антигенами микроорганизмов, в результате образуются иммунные комплексы антиген-антитело и при люминесцентной микроскопии регистрируют свечение. Недостаток метода - приготовление флюоресцирующих специфических антител против каждого выявляемого антигена.
Непрямой метод имеет преимущество не только в более высокой чувствительности, но и в отсутствии необходимости получать меченые антисыворотки различной специфичности.
Специфические немеченые антитела связываются с антигеном и выявляются с помощью флюоресцирующих антииммуноглобулиновых антител против иммуноглобулинов вида, которому принадлежат специфические данному антигену антитела.
Свечение, выявляемое при люминесцентной микроскопии, обусловлено фиксацией флюоресцирующих антиглобулиновых антител на иммунном комплексе антиген-специфическое антитело.
Постановка реакции.
На специальном предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, стёкла помещают во влажную камеру, инкубируют в течение 15 мин. при температуре 37 С, промывают препарат и наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против иммуноглобулинов кролика, инкубируют в термостате и промывают препарат.
Метод иммунофлюоресценции используется в лабораторной диагностике для обнаружения специфических антинуклеарных антител, характеристики их расположения; определения популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток.
Иммунофлюоресцентные методы широко используются для обнаружения аутоантител и антител к тканевым и клеточным антигенам. Используя срезы тканей (содержащих большое число антигенов), на одном предметном стекле можно выявить антитела к нескольким разным антигенам, установив при этом их внутритканевое (клеточное) или внутриклеточное распределение.
РИФ основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, В-изотицианит, лиссатинродамин В-200, сульфохлорид и др.), имеющими реакционно-способные группы (сульфохлорид, изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со свободными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы АГ-АТ становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микроскопом (рис 48). С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количества бактериальных и вирусных антигенов. Метод РИФ используют в двух вариантах: прямой и непрямой метод.
Прямой метод основан на непосредственном соединении антигена с меченым антителом. Непрямой метод - на поэтапном выявлении комплекса АГ-АТ с помощью флуоресцентных красителей. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов определенного антигена со специфическими антителами. Второй этап - в выявлении этого комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином.
Преимущество РИФ - простота, высокая чувствительность, скорость получения результата. РИФ применяется как метод ранней экспресс-диагностики гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения такого исследования используется люминесцентный микроскоп.
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД (ИФМ)
Метод разработан в 70-х годах шведскими учёными Энгвал-лом и Перлманном, голландскими учёными Ван Вееменом и Шууром и американскими исследователями под руководством Рубинстайна.
Метод широко используются в лабораторной клинической иммунологии для диагностики инфекционной патологии, включая ВИЧ-инфекцию, дефектов гуморального и клеточного звеньев иммунной системы, в аутоиммунной патологии и в массовых эпидемиологических исследованиях.
В силу чрезвычайно мощной каталитической активности ферменты наиболее чувствительны и универсальны в качестве метки. В качестве ферментов-маркеров используются щелочная фосфатаза, ацетилхолинэстераза, бетта-галактозидаза, пероксида-за хрена и т.д. Каталитическая активность ферментов различна и зависит от его конформационных свойств. Большинство используемых ферментов за 1 мин. при обычной температуре способны превращать в компоненты 10 молекул субстрата в расчете на одну молекулу фермента.Иммунопероксидазные методы наиболее просты и эффективны при анализе срезов тканей, обнаружении антигенов после электрофоретического разделения. Введение в систему МкАт повышает специфичность ИФА.
Существует множество модификаций метода ИФА, но наиболее известным и используемым в практике является гетерогенный ИФА. В качестве «твердой фазы» используют полистирол, полиэтилен, сефадекс, акриламид, целлюлозу, бумажный диск и др.
Среди гетерогенных методов различают конкурентный, неконкурентный, «сэндвич» (англ, sandwich — бутерброд), ингибиторный прямой и непрямой.
В последнее время выпускаются тест-системы, где в качестве твердой фазы используются различные материалы: бумажные диски, бусинки, парамагнитные частицы и др.
Чувствительность ИФА высокая.Специфичность определяется чистотой антител, используемых в системе.
Иммунологический лигандный метод применяется в двух вариантах: конкурентный, неконкурентный.
Твердофазный вариант метода наиболее популярен, так как упрощает разделение свободных и связанных компонентов реакции.
При иммуноферментном твердофазном варианте метода осуществляют выявление антигенов или антител с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой).После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляю! субстрат пероксидазы - перекись водорода.
Субстрат расщепляется ферментом, что в конечном итоге приводит изменению цвета продукта реакции: интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
Твердофазный ИФА — вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, например в лунках планшеток из полистирола.
Конкурентный твердофазный ИФА
При наличии в исследуемой сыворотке специфических антител происходит их связывание с антигеном на твёрдой фазе, субстрате, в результате чего специфичные антитела, меченные ферментом, не взаимодействуют со связанным антигеном - отмечается низкое содержание маркёра.
При отсутствии специфических антител в исследуемой сыворотке, иммунного комплекса антиген-антитело не образуется, а так как антиген, находящийся на твёрдом субстрате, не связался, то специфические антитела, меченные ферментом, взаимодействуют с ним, в результате чего определяют высокое содержание маркёра.

Приложенные файлы

  • docx 5830080
    Размер файла: 67 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий