определение активности пероксидазы

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ
Объект: листья или корни высших растений.
Цель работы: определить активность пероксидазы (ПО) в гетеротрофных и автотрофных тканях; сравнить активность пероксидазы у разных видов высших растений.
Ход работы:
Навеску растительного материала 50–100 мг (необходимо точно записать массу) растирают в ступке с небольшим количеством (около 5 мл) 0,06 М фосфатного буфера, рН 6,7. Растёртую массу количественно переносят в мерную колбу на 50 мл, доводят до метки тем же буфером, хорошо перемешивают и оставляют на 15 мин. Затем раствор фильтруют через двойной бумажный фильтр в стаканчик. Фильтрат (вытяжку) используют для определения активности фермента.
Активность фермента измеряют фотометрически на ФЭКе при 440 нм. При окислении некоторых фенолов (например, гваякола) пероксидазой образуется окрашенный продукт и оптическая плотность раствора при 440 нм увеличивается. Реакция, проходящая в реакционной среде:
пероксидаза фенол + Н2О2 > хинон + 2Н2О

Для измерения оптической плотности используют три кюветы по 8 мл (контроль и две химические повторности). В каждую из трёх кювет вносят:
2 мл вытяжки,
2 мл 0,06 М фосфатного буфера, рН 6,7,
2 мл гваякола.

После этого в контрольную кювету вносят 2 мл дистиллированной воды, устанавливают её внутри ФЭКа и вводят в световой луч. Ручками грубой и точной настройки нуля устанавливают "0"оптической плотности по контрольной кювете.
Одну из опытных кювет устанавливают внутри ФЭКа и вводят в световой луч. Автоматической пипеткой вносят в опытную кювету 2 мл 0,3% раствора перекиси водорода и одновременно включают секундомер. Записывают значения оптической плотности через каждые 5 (–20–60) секунд. Необходимо снять 5–10 точек. Таким же способом измеряют вторую опытную кювету.
Строят график зависимости оптической плотности D440 от времени t. На графике находят линейный участок и вычисляют скорость изменения оптической плотности D’440 = (D4402 – D4401) / (t2 – t1). (D’440 вычисляется по численным значениям, а не измеряется по графику!)
Активность пероксидазы АПО рассчитывают по формуле:

D’ * N (ед. опт. плотн.)
АПО = []
mсыр. * lкюв. (г сыр.массы) * (сек)

D’440 – скорость изменения оптической плотности [ед.опт.плот. / сек]
N – разведение
mсыр. – сырая масса навески [г]
lкюв. – толщина кюветы [см] (lкюв. = 2 см)

В выводах указать рассчитанную активность фермента, сравнить активность фермента в разных органах / видах / условиях выращивания растений, объяснить возможные причины различий на основе сведений о функциях фермента в растении.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ
Объект: листья или корни высших растений.
Цель работы: определить активность полифенолоксидазы (ПФО) в гетеротрофных и автотрофных тканях; сравнить активность полифенолоксидазы у разных видов высших растений.
Ход работы:
Навеску растительного материала 250–500 мг (необходимо точно записать массу) растирают в ступке с небольшим количеством (около 5 мл) 0,06 М фосфатного буфера, рН 7,0–7,4. Растёртую массу количественно переносят в мерную колбу на 25 мл, доводят до метки тем же буфером, хорошо перемешивают и оставляют на 15 мин. Затем раствор фильтруют через двойной бумажный фильтр в стаканчик. Фильтрат (вытяжку) используют для определения активности фермента.
Активность фермента измеряют фотометрически на ФЭКе при 590 нм. При окислении фенолов полифенолоксидазой в присутствии диэтилпарафенилендиамина образуется окрашенный продукт и оптическая плотность при 590 нм увеличивается. Реакции, проходящие в реакционной среде:



2


+


О2

полифенолоксидаза
>


2

+


2 Н2О

пирокатехин




ортохинон






+



>



+


ортохинон

парафенилен- диамин

пирокатехин

окрашенный продукт


Для измерения оптической плотности используют три кюветы по 8 мл (контроль и две химические повторности). В каждую из трёх кювет вносят:
2 мл вытяжки,
2 мл 0,06 М фосфатного буфера, рН 7,0 –7,4,
2 мл 0,02% раствора диэтилпарафенилендиамина.

После этого в контрольную кювету вносят 2 мл дистиллированной воды, устанавливают её внутри ФЭКа и вводят в световой луч. Ручками грубой и точной настройки нуля устанавливают "0"оптической плотности по контрольной кювете.

Одну из опытных кювет устанавливают внутри ФЭКа и вводят в световой луч. Автоматической пипеткой вносят в опытную кювету 2 мл 1% раствора пирокатехина и одновременно включают секундомер. Записывают значения оптической плотности через каждые 5 (–20–60) секунд. Необходимо снять 5–10 точек. Таким же способом измеряют вторую опытную кювету.
Строят график зависимости оптической плотности D590 от времени t. На графике находят линейный участок и вычисляют скорость изменения оптической плотности D’590 = (D5902 – D5901) / (t2 – t1). (D’590 вычисляется по численным значениям, а не измеряется по графику!)
Активность полифенолоксидазы АПФО рассчитывают по формуле:

D’ * N (ед. опт. плотн.)
АПФО = []
mсыр. * lкюв. (г сыр.массы) * (сек)

D’590 – скорость изменения оптической плотности [ед.опт.плот. / сек]
N – разведение
mсыр. – сырая масса навески [г]
lкюв. – толщина кюветы [см] (lкюв. = 2 см)

В выводах указать рассчитанную активность фермента, сравнить активность фермента в разных органах / видах / условиях выращивания растений, объяснить возможные причины различий на основе сведений о функциях фермента в растении.


Литература:
Физиология растений: учебник для студ. вузов. Под ред. И.П. Ермакова. – М.: Издательский центр "Академия", 2005 или 2007:
реакция сверхчувствительности – с. 464-465, 617-619;
вторичный метаболизм – с. 588-593;
лигнин – с. 81-81, с. 600 (рис.);
АФК – с. 261-271.
15

Приложенные файлы

  • doc 1984503
    Размер файла: 64 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий